15. Βλαστικά ή αρχέγονα κύτταρα (stem cells): ρόλος, τρόποι απομόνωσης και διατήρησης, σχέση τους με τον καρκίνο και μελλοντικές θεραπευτικές προοπτικές.
Τα βλαστικά κύτταρα είναι πρωταρχικής σπουδαιότητας κύτταρα κοινά για όλους τους πολυκύτταρους οργανισμοούς που διατηρούν τη δυνατότητα ανανέωσης μέσω της κυτταροδιαίρεσης και μπορούν να διαφοροποιηθούν σε ένα ευρύ φάσμα εξειδικευμένων τύπων κυττάρων. Η έρευνα στον τομέα των ανθρώπινων βλαστικών κυττάρων έγινε πιο έντονη μετά από τα συμπεράσματα των Καναδών επιστημώνων Ernest A. McCulloch και James E. Till το 1960. [1], [2]
Οι τρείς γενικές κατηγορίες stem cells που υπάρχουν στα θηλαστικά είναι: εμβρυικά stem cells, προερχόμενα από βλαστοκύστες, ενήλικα stem cells, που βρίσκονται στους ενήλικους ιστούς, και του αίματος του ομφάλιου λώρου stem cells, που βρίσκονται στον ομφάλιο λώρο. Σε ένα αναπτυσσόμενο έμβρυο, τα stem cells είναι σε θέση να διαφοροποιηθούν σε όλους τους εξειδικευμένους εμβρυικούς ιστούς. Στους ενήλικους οργανισμούς, τα stem cells και τα προγονικά κύτταρα δρούν ως σύστημα επισκευής για το σώμα, που ξαναγεμίζει με ειδικευμένα κύτταρα.
Σαν stem cells που είναι μπορούν να αυξηθούν εύκολα και να μετασχηματιστούν σε εξειδικευμένους ιστούς όπως οι μύες ή τα νεύρα κατευθείαν σε κυτταροκαλλιέργεια, έτσι λοιπόν έχει προταθεί η χρήση τους στην ιατρική θεραπευτική. Ειδικότερα, εμβρυικές γραμμές κυττάρων, αυτόλογα εμβρυικά stem cells παραγμένα κατευθείαν από θεραπευτική κλωνοποίηση, και ιδιαίτερα τα πλαστικά ενήλικα stem cells από το αίμα του ομφάλιου λώρου ή τον μυελό των οστών είναι ελπιδοφόροι υποψήφιοι.[3]
Τα ενήλικα βλαστικά κύτταρα έχουν βρεθεί σε πολυάριθμα κύτταρα και τύπους ιστού και μπορούν να μετασχηματιστούν ουσιαστικά σε όλα τα κύτταρα και τύπους ιστού, συμπεριλαμβανομένων των λειτουργικών ιστών.(Εικόνα 1)
Αν και είναι αλήθεια ότι ανθρώπινα ενήλικα stem cells δεν έχουν βρεθεί σε κάθε τύπο κυττάρων, έχουν βρεθεί σε πολλούς τύπους κυττάρων και ιστών όπως σε: εγκέφαλο (και το υπόλοιπο νευρικό σύστημα), μύες, αμφιβληστροειδή, πάγκρεας, μυελό των οστών και περιφερικό αίμα, κερατοειδή χιτώνας, αγγεία αίματος (ενδοθηλιακά κύτταρα), λίπος, οδοντικό πολτό, σπερματογόνια, και πλακούντα. Στην ουσία, όπου οι επιστήμονες έχουν αφιερώσει χρόνο και πόρους στον προσδιορισμό stem cells του ενήλικου ανθρώπου (και άλλων μη – εμβρυικών stem cells ), τα έχουν βρεί.[4]
Επιπλέον, σε πειράματα στα οποία χρησιμοποιούνται ζώα έχουν πρόσφατα απομονώσει πολλά επιπλέον ενήλικα stem cells και τύπους ιστού,όπως: δέρμα, συκώτι, και μαστικό αδένας. Λαμβάνοντας υπόψη τον εντυπωσιακό ρυθμό προσδιορισμού ενήλικων stem cells τα τελευταία λίγα έτη ( ο όποιος ακολούθησε απαρέκλητα τα βήματα:
(1ο ) προσδιορισμό και απομόνωση stem cells στα ζώα
(2ο ) προσδιορισμό και απομόνωση stem cells στους ανθρώπους ) ο επικείμενος προσδιορισμός και η απομόνωση ανθρώπινου ενηλίκου stem cell από αυτούς τους κυτταρούς τύπους και ιστούς είναι ιδιαίτερα πιθανός.[4]
Εικόνα 1 Πηγές βλαστικών κυττάρων και οι δυνατότητές τους [4]
Ο αυστηρός καθορισμός ενός κυττάρου ως βλαστικό απαιτεί να έχει αυτό δύο ιδιότητες:
1. Αυτο-ανανέωση - η δυνατότητα να περάσει από πολυάριθμους κύκλους κυτταρικής διαίρεσης διατηρώντας την αδιαφοροποίητη κατάσταση.
2. Απεριόριστη δραστικότητα - η ικανότητα να διαφοροποιηθεί σε οποιοδήποτε ώριμο τύπο κυττάρων. Υπό μια ακριβή έννοια, αυτό κάνει καθένα από τα βλαστικά κύτταρα παντοδύναμα ή πολυδύναμα, αν και μερικά πολυδύναμα και/ή προγονικά κύτταρα αναφέρονται μερικές φορές ως stem cells.
Αυτές οι ιδιότητες μπορούν να διευκρινιστούν in vitro, με χρησιμοποίηση μεθόδων όπως κλωνογενικές αναλύσεις, όπου χαρακτηρίζονται οι απόγονοι του απλού κυττάρου.[5][6]
Εντούτοις, οι in vitro συνθήκες μπορούν να αλλάξουν τη συμπεριφορά των κυττάρων, και καθιστούν ασαφές το αν τα κύτταρα θα συμπεριφερθούν κατά τρόπο παρόμοιο με τις in vivo.συνθήκες Η συζήτηση γίνεται για το εάν κάποιο προτεινόμενο ενήλικο κύτταρο οι πληθυσμοί κυττάρων είναι αληθινά stem cells.
Τα πολυδύναμα, εμβρυικά stem cells δημιουργήθηκαν ως εσωτερικά κύτταρα μάζα μέσα σε βλαστοκύστεις. Τα stem cells μπορούν να γίνουν οποιοσδήποτε ιστός στο σώμα, αποκλείοντας τον πλακούντα. Μόνο τα κύτταρα του μοριδίου είναι παντοδύναμα, ικανά να παράγουν όλους τους ιστούς και πλακούντα.
Η δραστικότητα διευκρινίζει τη δυνατότητα διαφοροποίησης (η δυνατότητα για διαφοροποίηση σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων) των stem cells.
· Παντοδύναμα (Totipotent) stem cells (Εικόνα 2) παράγονται από την τήξη ενός ωαρίου και ενός σπέρματοζωαρίου. Τα κύτταρα που παράγονται από τα πρώτα τμήματα του γονιμοποιημένου ωαρίου είναι επίσης παντοδύναμα. Αυτά τα κύτταρα μπορούν να διαφοροποιηθούν στους εμβρυικούς και εξωεμβρυϊκούς τύπους κυττάρων.
Εικόνα 2 [7]
· Ολοδύναμα (Pluripotent) stem cells (Εικόνα 3) είναι οι απόγονοι των παντοδύναμων κυττάρων και μπορούν να διαφοροποιηθούν στα κύτταρα που προέρχονται από τις τρείς βλαστικές στιβάδες.
Εικόνα 3 [8]
· Πολυδύναμα (Multipotent) stem cells (Εικόνα 4 )μπορούν να παραγάγουν μόνο τα κύτταρα μιας πολύ σχετικής οικογένειας κυττάρων (π.χ. αιματοποιητικά stem cells, διαφοροποιημένα σε ερυθροκύτταρα, λευκοκύτταρα, αιμοπετάλια, κτλ.).
Εικόνα 4 [9]
· Μονοδύναμα (Unipotent) stem cells (Εικόνα 5 )μπορούν να παραγάγουν μόνο έναν τύπο κυττάρων, αλλά έχουν την ικανότητα αυτοανανέωσης που τα διακρίνει από τα μή-stem cells.
Εικόνα 5 [10]
Εμβρυικά stem cell lines (ES cell γραμμές) (Εικόνα 6 )είναι ομάδες κυττάρων που προέρχονται από εξωδερματικό ιστό από την εσωτερική μάζα κυττάρων (ICM) της βλαστοκύστης. Η βλαστοκύστη είναι ένα αρχικό στάδιο εμβρύου - περίπου 4 με 5 ημερών στους ανθρώπους αποτελούμενο από 50-150 κύτταρα. Τα ES κύτταρα είναι πολυδύναμα, και αυξάνονται κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης σε όλα τα παράγωγα των τριών αρχικών βλαστικών στιβάδων: εξώδερμα, ενδόδερμα και μεσόδερμα. Με άλλα λόγια, μπορούν να αναπτυχθούν σε κάθε μία, σε περισσότερους από 200 τύπους κυττάρων των ενηλίκων ατόμων όταν δίνεται ικανοποιητική και απαραίτητη υποκίνηση για έναν συγκεκριμένο τύπο κυττάρων. Δεν συμβάλλουν στις εξωεμβρυϊκές μεμβράνες ή τον πλακούντα
Εικόνα 6 [11]
Όταν δεν δίνεται κανένα ερέθισμα για τη διαφοροποίηση, τα ES κύτταρα θα συνεχίζουν να διαιρούνται in vitro και κάθε ένα θυγατρικό κύτταρο θα παραμένει παντοδύναμο. Τα παντοδύναμα από τα ES κύτταρα έχουν καταδειχθεί αυστηρά in vitro και in vivo, και κατά συνέπεια μπορούν να ταξινομηθούν πράγματι στα βλαστικά κύτταρα. Λόγω των μοναδικών συνδυασμένων δυνατοτήτων απεριόριστης αύξησής τους και πολυδραστικότητας, τα εμβρυικά stem cells είναι μια πιθανή πηγή για την ιατρική στην αναπαραγωγή και αντικατάσταση ιστού μετά από τον τραυματισμό ή την ασθένεια. Μέχρι σήμερα, καμία εγκεκριμένη ιατρική περίθαλψη δεν έχει παραχθεί από έρευνα στα εμβρυικά stem cells. Αυτό δεν είναι παράξενο γνωρίζοντας ότι πολλά έθνη έχουν αυτήν την περίοδο στρέψει την προσοχή τους είτε στην έρευνα των ES κυττάρων, είτε στην παραγωγή των νέων γραμμών κυττάρων ES.
Ενήλικα stem cells είναι αδιαφοροποίητα κύτταρα, βρίσκονται σε όλο το σώμα και τα οποία διαιρούνται αναπληρώνοντας τα νεκρά κύτταρα και αναδημιουργόντας χαλασμένους ιστούς. Επίσης είναι γνωστό πως σωματικά stem cells, μπορούν να βρεθούν σε παιδιά, όπως και σε ενηλίκους. Σε πολλά ενήλικα stem cells η έρευνα έχει εστιαστεί στη διευκρίνιση της ικανότητάς να διαιρεθούν ή να αυτο-ανανεωθούν κατά τρόπο αόριστο και στη δυνατότητα διαφοροποίησής τους.[12]
Πολλά ενήλικα stem cells μπορούν να ταξινομηθούν καλύτερα σαν κύτταρα προγονικά, λόγω της περιορισμένης ικανότητάς τους για κυψελοειδή διαφοροποίηση.
Εντούτοις, συγκεκριμένα πολυδύναμα ή ακόμα και μονοδύναμα ενήλικα προγονικά κύτταρα μπορούν να έχουν πιθανή χρησιμότητα στην αναπαραγωγική ιατρική. Η χρήση των ενηλίκων stem cells (Εικόνα 7 )στην έρευνα και τη θεραπεία δεν είναι αμφισβητούμενη όπως στα εμβρυικά stem cells, επειδή η παραγωγή των ενηλίκων stem cells δεν απαιτεί την καταστροφή του εμβρύου. Σε αντίθεση με την έρευνα σε εμβρυικά stem cells, η περισσότερη χρηματοδότηση της Αμερικανικής κυβέρνησης έχει παρασχεθεί για την έρευνα στα ενήλικα stem cells. Ενήλικα stem cells μπορούν να απομονωθούν από ένα δείγμα ιστού αποκτηθέν από έναν ενήλικο. Έχουν μελετηθεί κυρίως σε ανθρώπους και πειραματόζωα όπως ποντίκια και αρουραίους.
Εικόνα 7 Ενήλικα βλαστικά κύτταρα [13]
Εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα (ES) πρωτοαπομονώθηκαν το 1980 από διάφορες ανεξάρτητες ομάδες. Αυτοί οι ερευνητές αναγνώρισαν την ολοδυναμική φύση των ES κυττάρων να διαφοροποιούνται σε άλλους τύπους κυττάρων και από τις τρείς αρχικές βλαστικές γραμμές. Ο Gossler και άλλοι. περιέγραξε τη δυνατότητα και τα πλεονεκτήματα της χρήσης ES κυττάρων στην παραγωγή διαγενετικών ζώων. Το επόμενο έτος, ο Thomas και ο Capecchi εξέθεσε τη δυνατότητα να αλλαχτεί το γονιδίωμα των ES κυττάρων με ομόλογο επανασυνδυασμό β Υ. Οι Smithies και οι συνάδελφοί του αργότερα περιέγραωαν ότι τα ES κύτταρα, τροποποιημένα με στοχοθέτηση γονιδίων όταν επανεισάγονται σε βλαστοκύστεις, θα μπορούσαν να διαβιβάσουν τη γενετική τροποποίηση στις βλαστικές γραμμές. Σήμερα, γενετική τροποποίηση του μυοειδούς γονιδιώματος με ES κυττάρων τεχνολογία είναι μια δημιουργική προσέγγιση στην κατανόηση της λειτουργίας των γονιδίων των θηλαστικών in vivo. Τα ES κύτταρα έχει αναφερθεί και σε άλλα είδη θηλαστικών (π.χ., χάμστερ, αρουραίους, βιζόν, γουρούνια, και αγελάδες), εντούτοις, μόνο σε μυοειδή ES κύτταρα έχει αναγνωριστεί επιτυχώς το γονιδίωμα σε ES κύτταρα από βλαστικές γραμμές. Πρόσφατα, ενδιαφέρον για την τεχνολογία των βλαστικών κυττάρων έχει προκείψει με την υποβολή έκθεσης της απομόνωσης πρωτευόντων και ανθρώπινων ES κυττάρων. ES κύτταρα απομονώθηκαν από εσωτερική κυτταρική μάζα (ICM) από έμβρυο σε κατάσταση βλαστοκύστης και, εάν διατηρούνται σε βέλτιστες συνθήκες, θα συνεχίσουν να αυξάνονται κατά τρόπο αόριστο σε μια αδιαφοροποίητη διπλοειδή κατάσταση. ES κύτταρα είναι ευαίσθητα σε αλλαγές του pH, και αλλαγές θερμοκρασίας, καθιστώντας επιτακτικό το να προσέχουμε αυτά τα κύτταρα καθημερινά. ES κύτταρα που δεν φροντίζονται, αυθόρμητα διαφοροποιούνται, ακόμη και με την παρουσία στρωμάτων τροφοδοτών και ανασταλτικών παραγόντων λευχαιμίας (LIF). Επιπλέον, υγιή κύτταρα αναπτυσσόμενα σε μακρά φάση είναι κρίσιμα για βέλτιστη αποδοτικότητα μετασχηματισμού σε πειράματα στοχοποίησης γονιδίων.Στοχοποιημένα μυοειδή ES κύτταρα έχουν μικρή αξία εάν χάσουν τη δυνατότητα να διαβιβάζουν τις εισαχθείσες μεταλλαγές μέσω βλαστικών γραμμών από τις προκύπτουσες χίμαιρες. Επομένως, είναι κρίσιμο ότι μυοειδή ES κύτταρα έχετε έναν κανονικό 40 XY καρυότυπο. Είναι τυποποιημένη πρακτική στο εργαστήριο να έχουμε την πλήρη καρυοτυπική ανάλυση από όλα τα στοχοθετημένα ES κύτταρα πριν από την παραγωγή των χιμαιρών. Τα κριτήρια που χρησιμοποιούνται στο εργαστήριό για να είναι κατάλληλοένα ES κύτταρο κλώνος για την παραγωγή των χιμαιρών είναι ότι τουλάχιστον το 50% του χρωμοσώματος spreads analyzed πρέπει να είναι 40 XY. Στα πειράματα DBA/1LacJ ES κύτταρα ικανοποιήθηκε ή υπερέβη εκείνο το κριτήριο τουλάχιστον στο 86% των περιπτώσεων, εκτιμώντας ότι 129 strain από ES κύτταρα ικανοποιήσαν ή υπερέβησαν τα κριτήρια στο 45% των περιπτώσεων. Οι πολλές ευκαιρίες που υπάρχουν στη βιολογία των βλαστικών κυττάρων σήμερα, συνδυασμένες με την ανάγκη γιά περαιτέρω εξερεύνηση και ανάπτυξη νέων τεχνολογιών, καθιστά απαραίτητη μια σαφή διαδικασία καθορισμού των βλαστικών κυτταρικών γραμμών. Επομένως, θα παρουσιάσουμε τις μεθόδους που χρησιμοποιούνται στο εργαστήριό για να αναπτυχθούν μυοειδή ES κυτταρικές γραμμές και να διατηρηθούν σε αδιαφοροποίητη κατάσταση.[14]
Υλικά
1. Ποντίκια για βλαστοκυστική κατάσταση εμβρύου και πρωταρχικοί εμβρυϊκοί ινοβλάστες
2. Καλλιέργειας ιστών πλαστικό και Γυαλικά
3. Μέσα και αντιδραστήρια [14]
Μέθοδοι
1. Προετοιμασία των μέσων που χρησιμοποιούνται για τροφοδότες και ES κύτταρα
2. Προετοιμασία για επίπεδα τροφοδοτών από PEF
3. Προετοιμασία πιάτων ντυμένων με ζελατίνη
4. Λήψη εμβρύων σε κατάσταση βλαστοκύστης
5. Καλλιέργεια της βλαστοκύστης και επιλογή από ICM
6. Απομόνωση υποθετικών ES κυττάρων από ICM
7. Χαρακτηρισμός υποθετικών ES κυττάρων
Είναι απαραίτητο να χαρακτηριστεί μια ES κυτταρική γραμμή για να καθοριστεί το φύλο, ο καρυότυπος, τα ολοδύναμα, και η απουσία παθογόνων. Προτιμάται να έχει μια αρσενική κυτταρική γραμμή, επειδή τα XY ES κύτταρα μπορούν να μετατρέψουν το φύλο της XX βλαστοκύστης σε μια χειμερική ανάπτυξη εμβρύου, και αυτό να καταλήξει σε χειμερικό αρσενικό που μπορεί να παραγάγει περισσότερους απόγονους από τα θηλυκά. Επιπλέον, είναι απαραίτητο να καθοριστεί ο καρυότυπος των ES κυτταρικών σειρών, επειδή μετάδοση του ES κυτταρικού γενώματος μέσω των βλαστικών σειρών από τις χίμαιρες εξαρτάται από το αν τα ES κύτταρα κατέχουν έναν κανονικό αριθμό χρωμοσωμάτων. Τέλος, η δυνατότητα να διαφοροποιηθούν σε πολλούς τύπους κυττάρων και η δυνατότητα να γίνουν οι υγιείς χίμαιρες εξαρτάται από τα κύτταρα που είναι χωρίς παθογόνα, όπως το μυκόπλασμα και οι μυοειδείς ιοί. Επομένως, είναι απαραίτητο να εξετάζουμε για μόλυνση από μυκόπλασμα και με δοκιμή μυοειδούς παραγωγής αντισωμάτων (MAP) για τα αντισώματα έναντι των μυοειδών ιών.
7.1. Προσδιορισμός φύλων για να προσδιορίσει XY ES κυτταρικές σειρές
7.2. Μυκοπλάσματος και μυοειδούς προερχόμενης από ιό δοκιμή μόλυνσης
7.3. In Vitro διαφοροποίηση (IVD)
7.4. Στοχοθέτηση γονιδίων δυνατότητα και βλαστικών σειρών μετάδοση
8. Συντήρηση των ES κυττάρων
8.1. Ξεπαγώνω ES κύτταρα
8.2. Καθημερινό τάϊσμα των ES κυττάρων
8.3. Υποκαλλιέργεια των ES κυττάρων
8.4. Πάγωμα των ES κυττάρων
9. Ηλεκτρομετασχηματισμός των ES κυττάρων για τη στοχοθέτηση γονιδίων
9.1. ES Προετοιμασία κυττάρων
9.2. Ηλεκτρομετασχηματισμός των κυττάρων ES
9.3. Αποικίες κυττάρων επιλογής ES
9.4. Επέκταση των επιλεγμένων αποικιών στις κλωνικές γραμμές κυττάρων ES
10. Προετοιμασία των κυττάρων ES για τις συναθροίσεις ή μικροέγχυση σε έμβρυα σε κατάσταση βλαστοκύστης.
10.1. Κούνημα ολόκληρου του πιάτου μέθοδος [14]
Συλλογή εμβρυϊκών stem cells σε εξελισσόμενες κυήσεις
Η συλλογή εμβρυϊκού μυελού των οστών ή εγκεφάλου είναι απίθανο να πραγματοποιηθεί ποτέ σε εξελισσόμενες κυήσεις. Τεχνικές με καθοδήγηση υπερήχου για συλλογή εμβρυϊκών ηπατικών ΗSC ή / και ΜSC για ex vivo επεξεργασία και επανεμφύτευση, έχουν αναφερθεί σε έμβρυα προβάτου, (Εικόνα 8) αλλά δε φαίνεται να είναι πραγματοποιήσιμες σε εξελισσόμενες κυήσεις. Ωστόσο, το εμβρυϊκό αίμα φαίνεται να αποτελεί μια πιο προσβάσιμη και ρεαλιστική πηγή stem cells. ΜSC συναντούνται σε εμβρυϊκό αίμα μόνο μετά τη 14η εβδομάδα της εγκυμοσύνης και η συλλογή τους σε εξελισσόμενες κυήσεις θα απαιτεί ασφαλή πρόσβαση στην πρώιμη εμβρυϊκή κυκλοφορία για απόκτηση ενός δείγματος εμβρυϊκού αίματος για το σκοπό αυτό. Τα τελευταία 15 - 20 χρόνια, σχετικά ασφαλείς τεχνικές πρόσβασης στην εμβρυϊκή κυκλοφορία, έχουν γίνει ρουτίνα για εμβρυϊκή διάγνωση και θεραπεία μετά την 16η εβδομάδα. Ενωρίτερα από στην κύηση, οι μέθοδοι περιορίζονται από το μικρό μέγεθος των εμβρυϊκών αγγείων. Παρόλα, αυτά, μία ομάδα ανέπτυξε μέθοδο λήψης δείγματος εμβρυϊκού αίματος με καθοδήγηση υπερήχου, σε εξελισσόμενη κύηση για τον κίνδυνο αιμοσφαιρινοπάθειων με ποσοστό απόρριψης μόνο 5% σε κυήσεις το ενωρίτερα 12 εβδομάδων. Πιο πρόσφατα, λεπτού διαμέτρου εμβρυοσκόπια έχουν γίνει διαθέσιμα και αυτά μπορούν να επιτρέψουν την πρώιμη λήψη δείγματος αίματος από ομφάλιο λώρο, κατω από άμεση όραση, αν και μέχρι σήμερα αυτό έχει εκτιμηθεί σε τερματιζόμενη εγκυμοσύνη.[14]
Εικόνα 8 Κατευθυνόμενη διαφοροποίηση εμβρυικών stem cells του ποντικιού [16]
Δυνατές εφαρμογές των εμβρυϊκών stem cells
Τα stem cells από οποιαδήποτε πηγή εντυπωσιάζουν, σαn μοντέλα αναπτυξιακής βιολογίας και για την υπόσχεση τους για τη θεραπεία ανθρώπινων ασθενειών. Η φύση των ιδιοτήτων τους είναι δυνατό να επισκοπηθεί, απομονώνοντας stem cells από το σώμα, αναπτύσσοντας αυτά κάτω από συνθήκες κυτταρικής καλλιέργειας, κατευθύνοντας τον πολλαπλασιασμό τους με αυξητικούς παράγοντες και μετά μεταμοσχεύοντας αυτά ή τους απογόνους τους σε ασθενείς όλων των ηλικιών για κλινικό κέρδος. Προς αυτήν τη κατεύθυνση, είναι δυνατό στο μέλλον να χρησιμοποιηθούν για ανακούφιση εκφυλιστικών διαταραχών, αντικατάσταση ασθενικών ή απορριφθέντων ιστών με μηχανικά υποκατάστατα, και διόρθωση γενετικών ασθενειών. Τα ΗSC έχουν ήδη αποδείξει την ικανότητα τους να παράγουν συνεχώς και κλωνικά όλους τους κυτταρικούς τύπους του αίματος και του ανοσοποιητικού συστήματος σε εμφυτευμένους δέκτες Τα ΜSC μπορούν να εφαρμοστούν θεραπευτικά για τη διόρθωση των διαταραχών μεσεγχυματικής αιτιολογίας και περαιτέρω δυνατή θεραπευτική εφαρμογή, βασίζεται στην ικανότητα τους να προάγουν τον ενοφθαλμισμό των ΗSC μετά από συμμεταμόσχευση. Εφόσον τα εμβρυϊκά stem cells μπορούν θεωρητικά να χρησιμοποιηθούν στη θέση των stem cells που προέκυψαν από ενήλικους ιστούς για περισσότερες από τις εφαρμογές, υπάρχουν μερικοί τομείς όπου αυτά μπορούν να έχουν ειδικά πλεονεκτήματα.[15]
Ενδομήτρια μεταμόσχευση
Η ενδομήτρια μεταμόσχευση αλλογενών stem cells αποτελεί μια νέα προσέγγιση για να αρθούν οι περιορισμοί της θεραπείας μετά τον τοκετό: που περιλαμβάνουν σοβαρή νοσηρότητα συνδεόμενη με θεραπεία και προϋπάρχουσα οργανική βλάβη που αναπτύσσεται πριν τη γέννα. Η μεταμόσχευση stem cells στην πρώιμη ενδομήτρια ζωή για διόρθωση γενετικών ελλειμάτων, έχει πολλά πλεονεκτήματα και με τη χρήση μάλλον εμβρυϊκών παρά ενηλίκων stem cells, μπορεί να προσφέρει πεισσότερα οφέλη, από τη στιγμή που τα εμβρυϊκά κύτταρα φέρουν ένα διακριτό πλεονέκτημα συναγωνισμιού σε σχέση με τα stem cells από ενήλικα. Η πρώιμη πραγματοποίηση της εμφύτευσης δότη stem cells προγενετικά, μπορεί να εμποδίσει ή να ελαττώσει ακόμη περισσότερο την παθολογία που συνδέεται με την υποκείμενη διαταραχή Κατά συνέπεια είναι σημαντικό να κατανοήσουμε τη σχετική αποτελεσματικότητα της εμφύτευσης εμβρυϊκών κυττάρων από διαφορετικές πηγές εμβρυϊκών κυττάρων, που πιθανώς εξαρτάται από τις ενδογενείς διαφορές στις απαιτήσεις κυτοκινών όπως επίσης και από τα εξωγενή σήματα που διαφέρουν στο εμβρυϊκό σε σχέση με το ενήλικο μικροπεριβάλλον.
Οι αρχικοί στόχοι που επιλέχθηκαν για ενδομήτρια μεταμόσχευση stem cells ήταν τα ΗSC, όχι μόνο εξαιτίας του καλά συνιστάμενου αναπαραγωγικού και πολυδιάστατου δυναμικού, αλλά επίσης εξαιτίας των ετών κλινικής εμπειρίας σε μεταμόσχευση σε ενήλικα. Μέχρι τώρα, οι περισσότερες προσπάθειες για μεταμόσχευση ΗSC ενδομητρίως έχουν αποτύχει, επειδή το έμρυο μέσου τριμήνου είναι ανοσο-ικανό και απορρίπτει αλλογενή κύτταρα. Αυτό το πρόβλημα μπορεί να προσπεραστεί από την πρώιμη μεταμόσχευση, πριν την απώλεια της ανοχής. Παρά τις προόδους στις τεχνικές λήψεις μυελού για πρώιμη συλλογή εμβρυϊκού αίματος από εξελισσόμενες εγκυμοσύνες, η χαμηλή παραγωγή των ΗSC, στο τέλος του πρώτου τριμήνου, μαζί με την περιορισμένη ικανότητα τους προς ανάπτυξη, καθιστά την προσέγγιση αυτή προβληματική Σε αντίθεση, ενήλικα ΜSC εμφυτεύονται ευρέως σε θηλαστικά, σε μοντέλα ενδομητρικής μεταμόσχευσης και φαίνεται να έχουν μοναδικά ανοσολογικά χαρακτηριστικά, που μπορούν να επιτρέψουν εμφύτευση ανεξάρτητη από την ηλικία της κυήσεως και την άνοσο-ικανότητα. Όταν μεταμοσχευθούν ενδομητρικά σε έμβρυο προβάτου, τα εμβρυϊκά ΜSC - μολονότι σε χαμηλό επίπεδο - ενοφθαλμίζονται σε πολλαπλά οργανικά διαμερίσματα και η συμμεταμόσχευση ενήλικων ΜSC έχει δείξει να προκαλεί ενδομητρική εμφύτευση ΗSC σε μοντέλα ζώων, δείχνοντας ότι η συμμεταμόσχευση εμβρυϊκών ΜSC μπορεί επίσης να οδηγήσει σε επιταχυνόμενη αιμοποιητική εμφύτευση. Το εμβρυϊκό ήπαρ έχει ήδη χρησιμοποιηθεί επιτυχώς για ενδομητρική θεραπεία εμβρύου με Χ-συνδεόμενη σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια.[15]
Γονιδιακή θεραπεία
Τα stem cells έχουν σημαντική χρησιμότητα ως φορείς γονιδιακής θεραπείας επειδή είναι αυτοανανεώσιμα, αίροντας την ανάγκη για συνεχιζόμενη χορήγηση του γονιδίου. Η ex vivo γονιδιακή θεραπεία χρησιμοποιεί αυτόλογα ΗSC, που λαμβάνονται πρώτα από έμβρυο, μετατρέπονται in vitro και μετά μεταμοσχεύονται πίσω στο έμβρυο. Αποτελέσματα από θεραπευτικές δοκιμές με γονίδια μετά τον τοκετό, αποδεικνύουν την κλινική αποτελεσματικότητα αυτής της προσέγγισης, αν και η γονιδιακή θεραπεία είναι υπό εξονυχιστική έρευνα από τη στιγμή που δύο παιδιά ανέπτυξαν λευχαιμία μετά από ex vivo γονιδιακή θεραπεία μετά τον τοκετό, πιθανώς σαν αποτέλεσμα της ικανότητας του ιού φορέα να διασπάσει ένα ογκογονίδιο. Άλλοι προβληματισμοί είναι η τρανσγονιδιακή έκφραση σε ιστούς διαφορετικούς από τον ιστό στόχο και η αθέλητη μεταφορά σε στελεχιαία σειρά (germline) κυττάρων. Τα βιολογικά πλεονεκτήματα της στόχευσης εμβρυϊκών ΜSC έναντι ΗSC για αυτόλογη γονιδιακή θεραπεία, περιλαμβάνουν την υψηλότερη αναπαραγωγική τους ικανότητα, τη μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα μεταμόρφωσης, το άμεσο δυναμικό ανάπτυξης, τη μειωμένη ανοσογενετικότητα, την ικανότητα να εμφυτεύονται και να διαφοροποιούνται στους περισσότερους τύπους ιστών και την ικανότητα να στοχεύονται μέσω συνδέσμων με συγκεκριμένους τύπους ιστών. Η προσέγγιση αυτή έχει το δυναμικό να θεραπεύσει ένα αρκετά μεγάλο αριθμό γενετικών παθήσεων, όπως οι βλεννοπολυσακχαριδώσεις, οι εγκεφαλικές γαγγλιοσιδώσεις, οι λευκοδυστροφΐες, η ατελής οστεογένεση και η μυϊκή δυστροφία.[15]
Μη επεμβατική προγενετική διάγνωση
Τα εμβρυϊκά stem cells παίρνουν στη μητρική κυκλοφορία κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης και έτσι αντιπροσωπεύουν μια δυνητικά μη επεμβατική πηγή γενετικού υλικού για προγενετική διάγνωση. Η έρευνα σε αυτόν το τομέα, έχει εμποδιστεί από τη απουσία κυτταρικών τύπων αποκλειστικών στο εμβρυϊκό αίμα και την ελαττωμένη συχνότητα των εμβρυϊκών κυττάρων να κινούνται διαμέσου του πλακούντα κατά τη διάρκεια της πρώιμης εγκυμοσύνης. Το διαφορετικό εύρος των κυτταρικών τύπων που κινούνται μέσα προς τη μητρική αιματική ροή περιλαμβάνει ΗSC και ΜSC, Οι εμβυικοί αιμοποιητικοί πρόγονοι, καταδεικνύονται στη μητρική κυκλοφορία από την πρώιμη εγκυμοσύνη και μετά. Ωστόσο, είναι δύσκολο να διακριθούν από τους προγόνους της εμβρυϊκής κυκλοφορίας και οι περισσότερες ομάδες είναι στερούνται της ικανότητας να αναπτύξουν εμβρυϊκά κύτταρα επαρκή in vitro για κλινική εφαρμογή. Τα εμβιηκά ΜSC, που κυκλοφορούν ατό εμβρυϊκό αίμα πρώτου τριμήνου, έχουν προταθεί σα μια εναλλακτική κυτταρική πηγή, για μη επεμβατική προγενετική διάγνωση, επειδή φαίνεται να μην έχουν ομόλογα στο αίμα ενηλίκου και μπορούν να αναπτυχθούν κλωνικά προς μία καθαρή πηγή εμβρυϊκών κυττάρων. Ωστόσο, αν και τα εμβρυϊκά ΜSC είναι πιθανό να διασχίζουν τον πλακούντα, σύμφωνα με θεωρητικούς υπολογισμούς και τα ευρήματα της ομάδας μας, ότι εμβρυϊκά Μ50 ανιχνεύονται σε μικρό ποσοστό των δειγμάτων μητρικού αίματος, αυτά φαίνεται να κυκλοφορούν σε πολύ χαμηλούς αριθμούς, καθιστώντας κάθε εφαρμογή στο χώρο της της μη επεμβατικής προγενετικής διάγνωσης, απίθανο.[15]
Μικροχιμαιρισμός
Η παρουσία εμβρυϊκών κυττάρων για χρόνια σε μητρικούς ιστούς, γνωστή σαν εμβρυϊκός μικριχιμαιρισμός, έχει ενοχοποιηθεί για αυτοάνοση νόσο διαμέσου της απάντησης μοσχεύματος κατά ξενιστή. Ωστόσο, η συχνότητα του εμβρυϊκού μικροχιμαιρισμού μετά από φυσιολογική εγκυμοσύνη και ο υπεύθυνος κυτταρικός τύπος είναι άγνωστα. Μια εξήγηση για την προφανή χαμηλή συχνότητα εμβρυϊκών ΜSC στο κυκλοφορούμενο μητρικό αίμα κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης είναι ο ενοφθαλμισμός στους μητρικούς ιστούς οστικού μυελού μετά από διαπλακουντική διέλευση. Η έκφραση μορίων κυτταρικής προσκόλλησης, στερούμενων της έκφρασης αντιγόνων ΗLΑ class II, μαζί με της προσκολλητικές ικανότητες των ΜSC in vivo, δεικνύουν ότι τα ΜSC μπορούν να διασπαρούν ευρέως και να εμφυτευθούν σε σε συνδετικούς ιστούς. Τα ΜSC που προέρχονται από ενήλικο μυελό των οστών, εμφυτεύονται άμεσα στα περισσότερα όργανα σε μοντέλα ζώων και επιλεκτικά κατασκηνώνουν σε οστικό μυελό μετά από έγχυση, εφόσον τα εμβρυϊκά ΜSC εμφυτεύονται διάχυτα, μετά από ξενο-μεταμόσχευση ενδομητρικά. Τα ΜSC, κατά συνέπεια, φαίνεται να αποτελούν τον πιο πιθανό εμβρυϊκό κυτταρικό τύπο, που επιμένει στους μητρικούς ιστούς. Εμείς πρόσφατα αναγνωρίσαμε εμβρυϊκό ΜSC από άρρεν, σε μετα-αναπαραγωγικό μυελό των οστών από θήλυ, μετά από περισσότερα από 50 χρόνια από την εγκυμοσύνη, σε μια ομάδα γυναικών που είχαν γιους.[15]
Ομφαλοπλακουντιακό αίμα (cord blood) είναι το ανθρώπινο αίμα από τον πλακούντα και τον ομφάλιο λώρο που είναι πλούσιο σε αιματοποιητικά stem cells. Συλλέγεται μετά από την αποσύνδεση του ομφάλιου λώρου από τα νεογέννητα, και χρησιμοποιείται ως πηγή stem cells για μεταμόσχευση. Αποθηκεύεται και από δημόσιες και από ιδιωτικές cord blood τράπεζες. Δημόσιες cord blood τράπεζες αποθηκεύουν το cord blood προς όφελος του ευρύτερου κοινού, και οι περισσότερες U.S. τράπεζες συντονίζουν το ταίριασμα του cord blood στους ασθενείς μέσω του Εθνικού Προγράμματος Δότη Μυελού (NMDP). Ιδιωτικές cord blood τράπεζες είναι κερδοσκοπικές οργανώσεις που αποθηκεύουν το cord blood για την αποκλειστική χρήση των δοτών ή συγγενών των δοτών. Δημόσιες cord blood τραπεζικές εργασίες υποστηρίζονται έντονα από την ιατρική κοινότητα. Εντούτοις, ιδιωτικές cord blood τραπεζικές εργασίες δεν συστήνονται γενικά εκτός αν υπάρχει ένα οικογενειακό ιστορικό γιά τις συγκεκριμένες γενετικές ασθένειες. Οι ιδιωτικές τραπεζικές εργασίες είναι παράνομες στη Γαλλία και την Ιταλία, και βρίσκουν αντίθετη την Ευρωπαϊκή ομάδα για την ηθική στην επιστήμη και τις νέες τεχνολογίες.[17]
Τα Cord blood stem cells είναι περισσότερο πολλαπλασιαστικά και έχουν μεγαλύτερη πιθανότητα να ταιριάζουν με μέλη των οικογενειών από τα stem cells του μυελού των οστών. Οι πατέρες έχουν μια πιθανότητα 25% να τεριάζουν με των παιδιών τους τα cord blood stem cells. Οι αμφιθαλείς έχουν μια πιθανότητα 25% να έχουν ένα τέλειο τέριασμα στα cord blood.[17]
Υπάρχουν δύο κύριες μέθοδοι για συλλογή cord blood από την ομφαλική φλέβα :προτού να παραδοθεί ο πλακούντας (in utero) ή κατόπιν (ex utero.) Με ex utero μέθοδο συλλογής, τα cord blood συλλέγονται αφότου παραδίδεται ο πλακούντας και ο ομφαλικός λώρος αφαιρείται από το νεογέννητο. Ο πλακούντας τοποθετείται σε μια αποστειρωμένη κατασκευή υποστήριξης με τον ομφαλικό λώρο ενωμένο μέσω της υποστήριξης. Το cord blood συλλέγεται από την δύναμη της βαρύτητας και είναι μεταξύ 40-150 mL. Μια παρόμοια μέθοδος συλλογής γίνεται για την in utero, εκτός από το ότι το cord blood συλλέγεται αφότου έχει παραδοθεί το μωρό αλλά πριν από την παράδοση του πλακούντα. Μετά από τη συλλογή οι cord blood μονάδες πρέπει αμέσως να σταλθούν σε μία cord blood τράπεζα. Στις κοινές cord blood τράπεζες, αυτό το αίμα αναλύεται στη συνέχεια για μολυσματικούς παράγοντες και τον καθορισμό του τύπου του ιστού. Το Cord blood υποβάλλεται σε επεξεργασία και απαλλάσσεται από τα ερυθροκύτταρα πρίν αποθηκευτεί σε υγρό άζωτο για μελλοντική χρήση.
Σχετικό βίντεο που δείχνει την διαδικασία [18] 
(κάντε κλίκ στην εικόνα για να δείτε το βίντεο)
Οι νέοι γονείς έχουν να επιλέξουν για το νεογέννητό τους ιδιωτική cord blood τράπεζα ή κοινή cord blood τράπεζα. Το κόστος ιδιωτικών cord blood τραπεζικών εργασιών είναι περίπου $2000 για τη συλλογή και περίπου $125 ετησίως για φύλαξη από το 2006. Η δωρεά cord blood μπορεί να μην είναι δυνατή σε όλες τις περιοχές, εντούτοις η ευκαιρία να δώσει κάποιος γίνεται πιό μεγάλη. Οι cord blood τράπεζες δεν θα χρεώσουν τον δότη για τη δωρεά, αλλά η OB/GYN μπορει ακόμα να χρεώσει μια συνολική αμοιβή $100-$250, που δεν καλύπτεται συνήθως από την ασφάλεια. [17]
Σύμφωνα με την έρευνα στο περιοδικό της παιδιατρικής αιματολογίας/ ογκολογίας (1997, 19:3, 183-187), οι πιθανότητες ένα παιδί να πρέπει να χρησιμοποιήσει τα ίδια του τα stem cells στην ηλικία των είκοσι ένα για τις τρέχουσες επεξεργασίες είναι περίπου 1:2,700, και οι πιθανότητες ένα μέλος της οικογένειας να πρέπει να χρησιμοποιήσει εκείνα τα κύτταρα είναι περίπου 1:1,400. [19]
Μετά από τον πρώτο αμφιθαλής-δότη cord blood μιά μεταμόσχευση εκτελέσθηκε το 1988, στο National Institute of Health (NIH) που επιχορηγήθηκε από τον Dr. Pablo Rubinstein για να αναπτύξει τα πρώτα προγράμματα των cord blood στο New York Blood Center(NYBC)[20], προκειμένου να συσταθεί ο κατάλογος από μη εμβρυϊκές stem cells μονάδες απαραίτητες να παρέχουν ανεξάρτητα, αντιστοιχισμένα εμβόλια για τους ασθενείς. Το 2005, στο University of Toronto ο ερευνητής Peter Zandstra ανέπτυξε μια μέθοδο για να αυξήσει την παραγωγή cord blood stem cells για να επιτρέψουν τη χρήση τους στη θεραπεία των ενηλίκων καθώς επίσης και των παιδιών.[21]
· Η λήψη του δείγματος αίματος θα πρέπει να γίνει πριν την υστεροτοκία.
· Η όλη διαδικασία απαιτεί περίπου 10 λεπτά.
· Το δείγμα θα πρέπει πάντα να βρίσκεται σε θερμοκρασία δωματίου από την ώρα της λήψης του μέχρι και την παράδοση του στα αργαστήρια και όχι στο ψυγείο.
· Ο χρόνος που μεσολαβεί από την λήψη του δείγματος έως και την παράδοσή του στα εργαστήρια συνίσταται να μην υπερβαίνει τις 48 ώρες.
· Σε περίπτωση δίδυμων, η ίδια διαδικασία επαναλαμβάνεται για κάθε παιδί, με ξεχωριστή συσκευασία συλλογής και τα αντίστοιχα απαραίτητα συμπληρωμένα έντυπα για το κάθε παιδί.
· Η διαδικασία είναι ίδια για φυσιολογικό τοκετό ή με καισαρική.
Η διαδικασία (Εικόνα 9)
1. Αμέσως μετά την γέννηση του μωρού, πιέζουμε τον ομφάλιο λώρο με δύο λαβίδες. Η μία λαβίδα θα πρέπει να τοποθετειθεί περίπου
2. Όπως συνηθίζετε, κόβουμε τον ομφάλιο λώρο ανάμεσα στις δυο λαβίδες και απομακρύνουμε το μωρό.
3. Αμέσως μετά, και πριν την αποκόλληση του πλακούντα, καθαρίζουμε καλά τον ομφάλιο λώρο με ένα αντισηπτικό.
4. Από την συσκευασία συλλογής της αφαιρούμε τον αποστειρωμένο ασκό λήψης του δείγματος αίματος, τον ξετυλήγουμε και τον τοποθετούμε κοντά μας για ευκολότερη λήψη.
5. Αφαιρούμε το προστατευτικό καπάκι από την βελόνα που συνδέεται με τον ασκό.
6. Με την βοήθεια της βελόνας, τρυπάμε τον ομφάλιο λώρο στην περιοχή που έχουμε προηγούμενος αποστειρώσει.
7. Υπάρχει το ενδεχόμενο να χρειασθεί να τρυπηθεί ο ομφάλιος λώρος σε περισσότερα του ενός σημεία. Σ' αυτήν την περίπτωση, αποστειρώνουμε και πάλι όλα αυτά τα σημεία με τον ίδιο ακριβώς τρόπο που ακολουθήσαμε προηγουμένως. Η αποστείρωση αποτελεί απαραίτητη προϋπόθεση για την αποφυγή οποιασδήποτε μόλυνσης του δείγματος.
8. Η ελάχιστη απαιτουμένη ποσότητα δήγματος αίματος είναι 80 ml (καθαρό από τα περίπου 35ml αντιπυκτικού CPD ενώ η μέγιστη χωρητικότητα του ασκού είναι 25ml. Γενικά, όσο περισσότερο αίμα από τον ομφάλιο λώρο καταφέρουμε να συλλέξουμε μέσα στον ασκό τόσα πιό πολλά βλαστικά κύτταρα θα βρεθούν και θα απομονωθούν.
9. Όταν θα έχει ολοκληρωθεί η διαδικασία λήψης του αίματος αδειάζουμε μέσα στον ασκό, το όποιο αίμα ενδεχομένως να έχει απομένει μέσα στον σωλήνα λήψης.
10. Κόβουμε την βελόνα η οποία συνδέεται με τον ασκό και στην συνέχεια την πετάμε.
11. Δένουμε τουλάχιστον δύο κόμπους στο σωλήνα λήψης. Συμπληρωματικά, χρησιμοποιούμε και την ειδική λαβίδα (clamp) που βρίσκεται μέσα στην συσκευασία συλλογής. (Δεν χρησιμοποιούμε ράμματα).
12. Ανακινούμε καλά τον ασκό με μερικές αργές κινήσεις για να αναμιχθεί το αίμα με το αντιπηκτικό.
13. Τοποθετούμε το δείγμα μέσα σε ειδική εξωτερική συσκευασία.[22]
Εικόνα 9 [22]
Όταν απαιτείται κρυοδιατήρηση (Εικόνα 10) του cord blood, είναι ξεπαγωμένο, πλυμένο με κρυοπροστατευτικό, και εγχυσμένο μέσω μιας φλέβας του ασθενή. Αυτό το είδος επεξεργασίας, όπου τα stem cells συλλέγονται από έναν άλλο δότη, καλείται αλλογενική επεξεργασία. Όταν τα κύτταρα συλλέγονται από τον ίδιο τον ασθενή στον οποίο θα χρησιμοποιηθούν, καλείται αυτόλογη και όταν συλλέγεται από τα συγγενικά άτομα, αναφέρεται ως συγγενική. Ξενογενική μεταφορά κυττάρων (μεταξύ διαφορετικών ειδών) είναι πολύ υπανάπτυκτη και γινεται για να υπάρχει κάποια ερευνητική δραστηριότητα.[17]
Εικόνα 10 Τα βλαστικά κύτταρα του ομφαλοπλακουντιακού αίματος φυλάσσονται, όπως άλλωστε και άλλοι βιολογικοί ιστοί, σε ειδικά δοχεία βαθιάς κατάψυξης. Οι χαμηλές θερμοκρασίες (της τάξεως των 190 βαθμών Κελσίου υπό το μηδέν) επιτυγχάνονται με τη χρήση υγρού αζώτου [22]
Ξεκινώντας προς το τέλος του 1980, μετά από μία επιτυχή μεταμόσχευση αμφιθαλή δότη, cord blood stem cells χρησιμοποιήθηκαν για να αντιμετωπιστεί ένας αριθμός από γενετικές ασθένειες σχετικές με το αίμα και το ανοσοβιολογικό σύστημα, καρκίνους, και άλλες διαταραχές. Λόγω των ιατρικών ζητημάτων γύρω από τη χρησιμοποίησή κάποιων ιδίων κυττάρων, σχεδόν σε κάθε περίπτωση οι επεξεργασίες γίνονται με χρησιμοποίηση κυττάρων από άλλο δότη, στη πλειοψηφία να χρησιμοποιούνται ανεξάρτητοι δότες. Το 1993, ο Dr. Joanne Kurtzberg, από το
Αυτές αφορούν κυρίως την πλειονότητα των δυσλειτουργιών του αιμοποιητικού και ανοσοποιητικού συστήματος που αντιμετωπίζονται με μεταμόσχευση αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων.
· Οξεία Λεμφοβλαστική Λευχαιμία – ALL
· Οξεία Μυελογενής Λευχαιμία – AML
· Χρόνια Μυελογενής Λευχαιμία – CML
· Χρόνια Λεμφοκυτταρική Λευχαιμία – CLL
· Παιδική Χρόνια Μυελογενής Λευχαιμία – JCML
· Παιδική Μυελομονοκυτταρική Λευχαιμία – JMML
· Χρόνια Μυελομονοκυτταρική Λευχαιμία – CMML
· Λέμφωμα Hodgkin's
· Λέμφωμα Non- Hodgkin's
· Νευροβλάστωμα
· Αμφιβληστροειδοβλάστωμα
· Λέμφωμα Burkitt
· Μυελοδυσπλαστικό σύνδρομο
· Διαθλαστική Αναιμία – RA
· Αναιμία Fanconi
· Σοβαρή Απλαστική αναιμία
· Δρεπανοκυτταρική Αναιμία
· Αναιμία Blackfan – Diamond
· Αναιμία Cooley's
· Αιμογλοβινοπάθειες
· Δικτυοερυθροκυτταρική Δυσγενεσία
· Σοβαρή Συνδυαστική Ανοσοανεπάρκεια – SCID
· Σύνδρομο Omenn
· Λεμφουπερπλαστική νόσος
· Συνδρομο Kostmann
· Θρομβασθένεια Glanzmann
· Νοσος Ataxia Telangiectasia
· Σύνδρομο DiGeorge
· Σύνδρομο Chediak – Higashi
· Μυέλωμα
Οι παρακάτω αποτελούν ασθένειες για τις οποίες έχει ήδη εφαρμοστεί η μεταμόσχευση βλαστικών κυττάρων, αλλά δεν αποτελεί ακόμη καθιερωμένη θεραπεία.
· Σύνδρομο Hurler
· Καρκίνος του μαστού
· Σάρκωμα Ewing's
· Αδρενολευκοδυστροφία – ALD
· Νόσος Krabbe
· Ιστιοκυττάρωση Κυττάρων Langerhans
· Οστεοπέτρωση
· Σκλήρυνση κατά πλάκας
· Αιμοφαγοκυττάρωση
· Νόσος Gaucher
· Νόσος Niemann – Pick
· Σύνδρομο Hunter's
· Νόσος Tay- Sachs
· Κυτταρική Καρδιομυοπλαστία
Μελέτες διεξάγονται σε ερευνητικά κέντρα ανά τον κόσμο για τη χρήση των βλαστικών κυττάρων ως θεραπευτικό μέσο και για την αντιμετώπιση και άλλων νοσημάτων - δυσλειτουργιών. Αυτές βρίσκονται ακόμη σε πειραματικό στάδιο και η κλινική τους εφαρμογή θα αποδειχθεί μελλοντικά.
· Παιδική αρθρίτιδα
· Ρευματοειδής αρθρίτιδα
· Νόσος Crohn's
· Διαβήτης
· Σύνδρομο Evan
· Λύκος
· Νόσος Huntington's
· Νόσος Parkinson's
· Νόσος Alzheimer's
· Ανάπλαση οργάνων, όπως νεφρά και ήπαρ. [25]
Για να εξασφαλίσουν αυτο-ανανέωση, τα stem cells υφίστανται δύο τύπους κυτταροδιαιρέσεων. Συμμετρική διαίρεση δίνει δύο ίδια θυγατρικά κύτταρα και τα δύο προικισμένα με stem cell ιδιότητες. Ασυμμετρική διαίρεση, αφ' ετέρου, παράγει μόνο ένα stem cell και ένα κύτταρο προγονικό με περιορισμένη δυνατότητα αυτο-ανανέωσης. Προγονικά βλαστικά κύτταρα μπορούν να περάσουν από διάφορους κύκλους κυτταροδιαίρεσης πρίν από το τέλος της διαφοροποίησής τους σε ένα ώριμο κύτταρο. Είναι δυνατό ότι η μοριακή διάκριση μεταξύ των συμμετρικών και ασυμμετρικών διαιρέσεων βρίσκεται στο διαφορικό διαχωρισμό από τις πρωτεϊνες των μεμβρανών των κυττάρων (όπως οι υποδοχείς) μεταξύ των θυγατρικών κυττάρων, εντούτοις, δεν υπάρχει κανένα στοιχείο για αυτόν τον μηχανισμό.
Μια εναλλακτική θεωρία είναι ότι αυτά τα stem cells παραμένουν αδιαφοροποίητα από περιβαλλοντικά αίτια στην ιδιαίτερη θέση τους. Stem cells διαφοροποιούνται όταν φεύγουν από αυτή τη θέση ή δεν λαμβάνουν πλέον εκείνα τα σήματα. Μελέτες στη drosophila germarium έχει προσδιορίσει σήματα dpp και adherins συνδέσεις που αποτρέπουν τα germarium stem cells από τη διαφοροποίηση [26][27].
Τα σήματα που οδηγούν στον επαναπρογραμματισμό από τα κύτταρα σε μια κατάσταση ομοιάζουσα με την εμβρυική, επίσης ερευνάται. Αυτά τα μονοπάτια σήματος περιλαμβάνουν αρκετούς παράγοντες μεταγραφής συμπεριλαμβανομένου του ογκογονιδίου c-Myc. Οι αρχικές μελέτες δείχνουν ότι ο μετασχηματισμός των κυττάρων των ποντικιών με έναν συνδυασμό από τα σήματα αντι - διαφοροποίησης μπορεί να αντιστρέψει τη διαφοροποίηση και μπορεί να επιτρέψει τα ενήλικα κύτταρα για να γίνουν πολυδύναμα.[28]
Εντούτοις, η ανάγκη να μετασχηματίσει αυτά τα κύτταρα με ένα ογκογονίδιο μπορεί να αποτρέψει τη χρήση αυτής της προσέγγισης στη θεραπεία.
Οι ιατρικοί ερευνητές θεωρούν ότι αυτή η θεραπεία με τα stem cells έχει τη δυνατότητα να αλλάξει ριζικά την αντιμετώπιση της ανθρώπινης ασθένειας. Θεραπεία με διάφορα ενήλικα stem cells υπάρχει ήδη, ιδιαίτερα για μεταμοσχεύσεις του μυελού των οστών που χρησιμοποιούνται για την αντιμετώπιση της λευχαιμίας.[29]
Στο μέλλον, ιατρικοί ερευνητές προσδοκούν να χρησιμοποιήσουν τις τεχνολογίες προερχόμενες από την έρευνα στα stem cells για να αντιμετωπίσουν μια ευρύτερη ποικιλία από ασθένειες συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου, την ασθένεια του parkinson, βλάβες στο νωτιαίο μυελό, και ζημία μυών, μεταξύ ενός αριθμού από άλλες βλάβες και καταστάσεις.[30][31]
Εντούτοις, ακόμα υπάρχει πολύ κοινωνική και επιστημονική αβεβαιότητα να περιβάλει την έρευνα των stem cells, που μπορεί ενδεχομένως να υπερνικηθεί μέσω της δημόσιας συζήτησης και της μελλοντικής έρευνας.
Stem cells, εντούτοις, χρησιμοποιούνται ήδη εκτενώς στην έρευνα, και μερικοί επιστήμονες δεν θεωρούν τη θεραπεία κυττάρων ως πρώτο στόχο της έρευνας, αλλά βλέπουν την έρευνα των stem cells σαν στόχο αντάξιο τους. [32].
Ολοδύναμα ανθρώπινα stem cells απομονωμένα από πρόωρα έμβρυα αντιπροσωπεύουν μια ενδεχομένως απεριόριστη πηγή για πολλούς διαφορετικούς τύπους κυττάρων για θεραπεία γονιδίων βασισμένη σε κύτταρα και ιστούς. Εντούτοις, εάν η πλήρης δυνατότητα των γραμμών κυττάρων προερχόμενα από έμβρυα δοτών πρόκειται να πραγματοποιηθεί, πρέπει να υπερνικηθεί το πρόβλημα του ταιριάσματος του ιστού του δότη με αυτό του δέκτη. Μια προσέγγιση, η οποία αποφεύγει το πρόβλημα της απόρριψης από τη μεταμόσχευση, θα ήταν να καθιερωθούν stem cells γραμμές από τα ίδια τα κύτταρά του μέσω της θεραπευτικής κλωνοποίησης. Οι πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι είναι δυνατό να μεταφερθεί ο πυρήνας από έναν ενήλικο σωματικό κύτταρο στο ωοκύτταρο που είναι απαλλαγμένο από τα μητρικά χρωμοσώματα, και να επιτευχθεί η εμβρυική ανάπτυξη υπό έλεγχο του μεταφερμένου πυρήνα. Τα Stem cells απομονομένα από ένα τέτοιο κλωνοποιημένο έμβρυο θα ήταν γενετικά ίδια με αυτά του ασθενή και δεν τίθεται κανένας κίνδυνος ανοσοαπόρριψης. Η απομόνωση των ολοδύναμων stem cells ποντικών από τους επαναπρογραμματισμένους ενήλικους πυρήνες σωματικών κυττάρων έχει μελετηθεί. Τα έμβρυα παρήχθησαν από την άμεση έγχυση από μηχανικά απομονωμένους πυρήνες σωρών κυττάρων στα ώριμα ωοκύτταρα. Εμβρυικά stem (ES) cells απομονωμένα από σωρούς- κύτταρο-παραγόμενων βλαστοκύστεων επέδειξαν τη χαρακτηριστική μορφολογία και έκφραση δεικτών συμβατικων ES cells και υποβλήθηκαν σε εκτενή διαφοροποίηση και στις τρείς εμβρυικές βλαστικές στιβάδες.(endoderm, mesoderm και ectoderm) στους όγκους, και στα χιμαιρικά έμβρυα. Τα ES cells παρουσιάστηκαν επίσης για να διαφοροποιήσουν εύκολα στους νευρώνες και το μυ σε καλλιέργειες. Τα ολοδύναμα stem cells μπορούν να προέλθουν από τους πυρήνες κατά το τέλος της διαφοροποίησης των ενήλικων σωματικών κυττάρων και προσφέρουν ένα πρότυπο σύστημα για την ανάπτυξη της θεραπείας που στηρίζεται σε αυτόλογα, ανθρώπινα ολοδύναμα stem cells. [33]
Τα stem cells του προστάτη, αρμόδια για την ανάπτυξη, ωρίμανση, και λειτουργία του προστάτη, έχουν εμπλεχτεί για την αιτιολογία σε δύο καλοήθεις υπερπλασίες του προστάτη (BPH) και προστατικούς καρκίνους (CaP). Εντούτοις, η έρευνα έχει παρακωλυθεί από την έλλειψη ενός οριστικού stem cell δείκτη. Έχει προσαρμοστεί το πρωτόκολλο για τη διαφορική λήψη Hoechst 33342 από αιμοποιητικά stem cells για να επιτρέψει την απομόνωση υποθετικών stem cells από τον προστάτη. Προστατικά επιθηλιακά κύτταρα που απομονώνονται από τον προστατικό ιστό αποκτηθέντα από τους ασθενείς με BPH μετά από την τρανσουριθρική οπισθοτομία από τον προστάτη χρωματίζονται με Hoechst 33342. Το Hoechst 33342 κόκκινο/μπλε κυτομετρικό σχεδιάγραμμα ροής σχεδιάζεται στη συνέχεια. Η Hoechst 33342 και η Pyronin Y χρησιμοποιείται για τη χρώση και καθορίζει τη θέση των κυτταρικών κύκλων.[34]
Αυτό το πρωτόκολλο υιοθετείται για τον καθαρισμό ενός πληθυσμού από κύτταρα παραγόμενα από μυ - από το σκελετικό μυ C57Bl/6 ζώων. Η προκύπτουσα προετοιμασία περιλαμβάνει ένα μίγμα πολλών τύπων κυττάρων συμπεριλαμβανομένων των δορυφορικών κυττάρων (a.k.a., προγονικών κύτταρα μυών) και αιμοποιητικά κύτταρα παραγόμενα από ενεργό μυ. Αυτό το πρωτόκολλο είναι βασισμένο σε αυτό που περιγράφεται από τον Yablonka-Reuveni και άλλους με μικρές τροποποιήσεις.
Συνοπτική περίληψη του πρωτοκόλλου:
1. Αφαιρούμε το μυ από τα χαμηλότερα άκρα και το διάφραγμα των ζώων και μεταφέρουμε
2. Αφαιρούμε τα κόκκαλα και τους τένοντες από το μυ.
3. Προσεκτικά κομματιάζουμε το μυ σε ένα ελάχιστο ποσό από HBSS+.
4. Μεταφέρουμε τον κομματιασμένο μυ σε φρέσκο 50 mL κωνικό σωλήνα και υποβάλουμε σε φυγοκέντρωση 2000 rpm για 3 λεπτά.
5. Απορρίπτουμε τον υπόλοιπο. Προσθέτουμε έναν ισοδύναμο όγκο από 0.2% κολαγενάση τύπου II. Το αναμιγνείουμε καλά και το επωάζουμε σε 37ºC υδρόλουτρο για 30 λεπτά, με καλή ανάμίξη κάθε 10 λεπτά.
6. (προαιρετικά) Προσθέτουμε 15 mL Hanks+ σε σωλήνα. Περιστροφή σε 3000 rpm για 5 λεπτά. Απορρίπτουμε τον υπόλοιπο. Προσθέτουμε έναν ισοδύναμο όγκο από 0.25% τρυψίνη. Επωάζουμε σε 37ºC για 30 λεπτά σε ένα λουτρό ύδατος για 30 λεπτά, και τα ανακατεύουμε καλά κάθε 10 λεπτά.
7. Εάν πηδήξουμε το βήμα 6, γεμίζουμε τον κωνικό σωλήνα με Hanks+ για να ξεπλύνουμε την κολαγενάση και θετουμε σε περιστροφή σε 3000 rpm για 5 λεπτά. Προσθέτουμε περίπου 10 mL DMEM/HS στο σωλήνα. Εάν συνεχίσουμε με το βήμα 6, προσθέτουμε 10 mL DMEM/HS άμεσα στο σωλήνα που περιέχει την τρυπσίνη και συνεχίζουμε με το επόμενο βήμα.
8. Κονιορτοποιώ το δείγμα σε 5 υποπολλαπλάσια DMEM/HS. Μεταφέρουμε αυτό σε φρέσκο 50 mL κωνικός σωλήνας.
9. Πέρασμα του κονιορτοποιημένου το οποίο μεταφέρεται κατευθείαν σε 100 nm φίλτρο. Συλλέγουμε τα κύτταρα από τη φυγόκεντρο 3000 rpm για 5 λεπτά και τα επαναρτούμε σε 3 mL Hanks+.
10. Προετοιμάζουμε την κλίση Percoll.
11. Ήπια αναστολή επικαλύψεων κυττάρων επάνω σε Percoll κλίση. Πλύσιμο 50 mL σωλήνας με 3 mL Hanks+ και προσθέτουμε την επικάλυψη επάνω στην ίδια κλίση προκειμένου να συλλεχθεί ο μέγιστος αριθμός κυττάρων.
12. Υποβάλουμε σε φυγοκέντρωση σε 2500 rpm για 20 λεπτά με διακοπή στους 25οC.
13. Αφαιρούμε τα κύτταρα από 70%/40% Percoll διεπαφή και τα μεταφέρουμε σε φρέσκο κωνικό σωλήνα. Γεμίζουμε τον κωνικό έως το χείλος με 1x PBS προκειμένου να ξεπλύνει το Percoll. Συλλέγουμε τα κύτταρα από τη φυγοκέντριση.
14. Μετράμε τα κύτταρα με αιματοκυτόμετρο. Χαρακτηριστικές παραγωγές κυττάρικής σειράς από 1x106 σε 2x106 κύτταρα/ ποντίκι.
Εικόνα 11 [35]
Από το 1953, ήδη, οι βιολόγοι είχαν καταφέρει να δημιουργήσουν κλώνους βατράχων (από κύτταρα γυρίνων), ωστόσο ο πρώτος επιτυχής κλωνισμός ενήλικου θηλαστικού, το 1996, εξέπληξε πολλούς αναπτυξιακούς βιολόγους.
Επί αρκετές δεκαετίες, ήταν γενικά παραδεκτό ότι τα κύτταρα που έχουν διαφοροποιηθεί και εξειδικευτεί σε μία λειτουργία δεν μπορούν να «επαναπρογραμματιστούν» ώστε να χρησιμοποιηθούν για την αναδημιουργία ενός πλήρους οργανισμού ή ιστών προς μεταμόσχευση. Ο λόγος είναι ότι στα διαφοροποιημένα κύτταρα είναι ενεργά μόνο τα γονίδια που απαιτούνται για κάποιες εξειδικευμένες λειτουργίες (π.χ. παραγωγή μιας ορμόνης), ενώ τα γονίδια που περιέχουν τις «κατασκευαστικές προδιαγραφές» για την ανάπτυξη ολόκληρου του οργανισμού έχουν πάψει να εκφράζονται.
Αυτό που απέδειξε με τη δημιουργία της Ντόλι η ερευνητική ομάδα του δρ. Ίαν Γουίλμουτ στο Ινστιτούτο του Ρόσλιν ήταν ότι τα διαφοροποιημένα κύτταρα μπορούν να «συγχρονιστούν» με τον κυτταρικό κύκλο του ωαρίου και να συγχωνευτούν με αυτό για να δώσουν ένα βιώσιμο έμβρυο. Φαίνεται ότι το ίδιο το ωάριο περιέχει παράγοντες που «διαγράφουν» το γενετικό πρόγραμμα των κυττάρων, επαναφέροντάς τα έτσι στην αρχή της αναπτυξιακής πορείας τους.
Η διαπίστωση αυτή έχει πιθανώς μεγάλη σημασία για την εξέλιξη της ιατρικής πρακτικής, καθώς θεωρητικά επιτρέπει την δημιουργία ιστών που είναι ανοσιολογικώς απόλυτα συμβατοί με τον πάσχοντα και θα μπορούσαν να μεταμοσχευτούν σε αυτόν χωρίς την ανάγκη χορήγησης -επικίνδυνων- ανοσοκατασταλτικών φαρμάκων. Τέτοια μοσχεύματα ονομάζονται αυτόλογα και μπορούν να δημιουργηθούν με πρώτη ύλη ένα δείγμα κυττάρων του ασθενούς, και ένα ωάριο από το οποίο έχει αφαιρεθεί ο πυρήνας.
Όταν τα έμβρυα που προκύπτουν βρίσκονται στο στάδιο της βλαστοκύστης (όταν αποτελούνται από λίγες δεκάδες έως εκατοντάδες κύτταρα) έχουν σχήμα κενής σφαίρας με πάχυνση στην μία πλευρά. (Εικόνα 11) Τα κύτταρα της περιοχής αυτής θα πολλαπλασιαστούν για να δώσουν ολόκληρο τον οργανισμό (τα υπόλοιπα κύτταρα του εμβρύου θα δώσουν τους εξωεμβρυϊκούς σχηματισμούς, όπως τον πλακούντα και τον ομφάλιο λώρο). Τα κύτταρα αυτά είναι ολοδύναμα, δηλαδή μπορούν να διαφοροποιηθούν προς οποιονδήποτε από τους (πάνω από 200) τύπους ιστών που αποτελούν το ανθρώπινο σώμα.
Τα αδιαφοροποίητα κύτταρα, που εξειδικεύονται ανάλογα με τις βιοχημικές συνθήκες στις οποίες αναπτύσσονται, περιγράφονται με τον γενικότερο όρο βλαστικά κύτταρα και υπάρχουν σε περιορισμένους αριθμούς και στον ενήλικο οργανισμό, όπως στον μυελό των οστών και το νευρικό σύστημα.
Τα βλαστικά κύτταρα των ενηλίκων δεν είναι εξίσου «ευέλικτα» με τα εμβρυϊκά αντίστοιχά τους και είναι, στην καλύτερη περίπτωση, πολυδύναμα, δηλαδή μπορούν να δώσουν ορισμένους από τους τύπους ιστών και όχι όλους.
Εικόνα 12 Καρδιακή βαλβίδα και αγγειακά μοσχεύματα που καλλιεργήθηκαν στα εργαστήρια της Advanced Cell Sciences [35]
Τα βλαστικά κύτταρα αναμένεται να προκαλέσουν μια πραγματική επανάσταση στην Ιατρική τις επόμενες δεκαετίες, και έχουν ήδη χρησιμοποιηθεί πειραματικά για την αντιμετώπιση εκφυλιστικών ασθενειών του εγκεφάλου, όπως η νόσος Πάρκινσον και Αλτσχάιμερ, για τη μερική αποκατάσταση των τραυμάτων του νωτιαίου μυελού που προκαλούν παράλυση, αλλά και για την παραγωγή καρδιακών, ηπατικών και επιθηλιακών κυττάρων προς μεταμόσχευση. (Εικόνα 12) Στις περισσότερες από τις έρευνες αυτές χρησιμοποιήθηκαν βλαστικά κύτταρα που απομονώθηκαν από έμβρυα πειραματόζωων. Σε αρκετές περιπτώσεις, οι ερευνητές δημιούργησαν έμβρυα - κλώνους και απομόνωσαν από αυτά κύτταρα, τα οποία στη συνέχεια επανεμφύτευσαν στο πειραματόζωο - δότη.
Η μελέτη των εμβρυϊκών κυττάρων επέτρεψε στους επιστήμονες να κατανοήσουν καλύτερα τους βιοχημικούς παράγοντες που καθορίζουν τη διαδικασία διαφοροποίησης και να αξιοποιήσουν με τον καλύτερο δυνατό τρόπο τα βλαστικά κύτταρα των ενηλίκων.
Τα τελευταία χρόνια, τα βλαστικά κύτταρα του μυελού των οστών έχουν αντικαταστήσει εν μέρει τα εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα στις πειραματικές μεθόδους καλλιέργειας ιστών. Οι ερευνητές που αντιτίθενται στη χρήση εμβρύων για ηθικούς λόγους διατείνονται ότι οι συνάδελφοί τους θα πρέπει να επικεντρωθούν στη μελέτη των βλαστικών κυττάρων από ενήλικες.
Πράγματι, κανείς δεν αποκλείει το ενδεχόμενο να υπάρξει στο μέλλον η δυνατότητα «εξαναγκασμένης» μετατροπής οποιουδήποτε τύπου ιστού του ενήλικου οργανισμού σε οποιονδήποτε άλλο. Πολλοί επιστήμονες, ωστόσο, θεωρούν ότι για την ανάπτυξη αποτελεσματικών μεθόδων καλλιέργειας αυτόλογων μοσχευμάτων είναι απολύτως απαραίτητη, προς το παρόν, η έρευνα σε ανθρώπινα έμβρυα, τα οποία μπορούν να προκύψουν και μέσω κλωνισμού.[35]
Υπάρχει μια διαδεδομένη διαμάχη στην έρευνα των stem cells που προέρχεται από τις τεχνικές τις χρησιμοποιούμενες στη δημιουργία και τη χρήση των stem cells. Η έρευνα στα εμβρυικά stem cells είναι ιδιαίτερα αμφισβητούμενη επειδή, με την παρούσα κατάσταση στην τεχνολογία, η έναρξη μιας stem cell γραμμής απαιτεί την καταστροφή του ανθρώπινου εμβρύου ή/και θεραπευτική κλωνοποίηση. Οι αντίπαλοι της έρευνας υποστηρίζουν ότι αυτή η πρακτική είναι ένας ολισθηρός δρόμος για την αναπαραγωγική κλωνοποίηση και ισοδύναμος με την ενοργάνωση ενός ανθρώπου. Αντιστρόφως, ιατρικοί ερευνητές στον τομέα υποστηρίζουν ότι είναι απαραίτητο να συνεχιστεί η έρευνα στο εμβρυικό stem cell επειδή οι επακόλουθες τεχνολογίες αναμένονται να έχουν σημαντική ιατρική δυνατότητα, και ότι τα έμβρυα που χρησιμοποιούνται για την έρευνα είναι μόνο εκείνα που έτσι και αλλιώς θα καταστρέφοταν. (σαν προϊόν γονιμοποίησης invitro ). Αυτό στη συνέχεια, οδηγεί σε συγκρούσεις με τους αντιπάλους που είναι κατά της άμβλωσης, οι οποίοι υποστηρίζουν ότι ένα έμβρυο είναι ένας άνθρωπος και επομένως έχει το δικαίωμα στην αξιοπρέπεια ακόμα κι αν νόμιμα πρόκειται να καταστραφεί. Η επόμενη συζήτηση έχει προτρέψει τις αρχές σε όλον τον κόσμο να επιδιώκουν ρυθμιστικά νομικά πλαίσια λόγω του γεγονότος ότι η έρευνα στα stem cells αντιπροσωπεύει μια κοινωνική και ηθική πρόκληση.
Θα περιγράψουμε τις βασικές αρχές των εννοιών της βιολογίας του καρκίνου, και θα ανασκοπήσουμε τις πρόσφατες προόδους στο ρόλο των καταστολέων στην γήρανση ,στην αύξηση των όγκων και την αναστολή αυτού του εμποδίου κατά τη διάρκεια του ξεκινήματος της αύξησης των όγκων. Στη γήρανση ο φαινότυπος μπορεί να προκληθεί από (1) γήρανση προκληθείσα από την φθορά των τελομερών στο τέλος της κυτταρικής μιτωτικής διάρκειας ζωής (MLS) και (2) επίσης από την αντιγραφή, επιταχυνόμενη γήρανση λόγω της ακούσιας ενεργοποίησης των ογκογονιδίων ή από την έκθεση των κυττάρων στανιδιοτοξίνες. Τα γονίδια p53/pRB/p16INK4A καταστολής όγκων (ογκοκατασταλτικά γονίδια) και τα σχετικά με την γήρανση σημεία ελέγχου περιλαμβάνονται στην εκτέλεση της αρχής της γήρανσης. Εντούτοις, η γήρανση ως μηχανισμός καταστολής όγκων είναι μια ελαττωματική διαδικασία και τα γηρασμένα κύτταρα με τις μεταλλαγές ή τις επιμεταλλαγές σε αυτά τα γονίδια διαφεύγουν την μιτωτική καταστροφή-προκληθέντα θάνατο των κυττάρων με το να γίνουν πολυπλοειδικά κύτταρα. Αυτά τα πολυπλοειδικά γιγαντιαίακύτταρα, προτού να πεθάνουν, δίνουν αφορμή για διάφορα κύτταρα με τα βιώσιμα γονιδιώματα μέσω της πυρηνικής βλάστησης και της ασυμμετρικής κυτταροκίνησης. Αυτός ο τρόπος κυτταροδιαίρεσης έχει κληθεί neosis και ο άμεσος neotic απόγονος κύτταρα Raju. Τα τελευταία κληρονομούν την γενωματική αστάθεια και παροδικά παρουσιάζουν τις ιδιότητες των βλαστικών κυττάρων δεδομένου ότι διαφοροποιούνται σε καρκινικά κύτταρα και την παρουσίαση εκτεταμένα, αλλά, όχι απεριόριστα MLS, στο τέλος του οποίου εισάγουν την φάση γήρανσης και μπορούν να υποβληθούν στον δευτερεύοντα/τριτεύοντα neosis για να παραγάγουν την επόμενη γενεά των κυττάρων Raju. Το Neosis επαναλαμβάνεται αρκετές φορές κατά τη διάρκεια της αύξησης των όγκων μιας μη-συγχρονισμένης διάπλασης, είναι ο τρόπος προέλευσης της ανθεκτικής αύξησης των όγκων και συμβάλλει στην ετερογένεια και τη συνοχή των καρκινικών κυττάρων. Το βασικό γεγονός κατά τη διάρκεια του neosis εμφανίζεται να είναι η παραγωγή του μιτωτικά βιώσιμου θηγατρικού γονιδιώματος μετά από την επιγενετική διαμόρφωση από το μη βιώσιμο πολυπλοειδικό γονιδίωμα του μητρικού κυττάρου neosis (NMC). Αυτό οδηγεί στην αύξηση των ανθεκτικών καρκινικών κυττάρων. Δεδομένου ότι κατά τη διάρκεια του neosis, το σημείο ελέγχου της ατράκτου δεν ενεργοποιείται, αυτό μπορεί να προκαλέσει την ανευπλοειδία. Κατά συνέπεια, τα καρκινικά κύτταρα επίσης προορίζονται για να πεθάνουν λόγω της γήρανσης, αλλά μπορούν να διαφύγουν την γήρανση λόγω των μεταλλαγών ή των επιμεταλλαγών στη διάβαση των σημείων ελέγχου της γήρανση. Η γένεση και η επαναλαμβανόμενη αναγένεση των κυττάρων Raju με το παροδικό "stemness" μέσω του neosis είναι ζωτικής σημασίας σπουδαιότητας στην προέλευση και τη συνεχή αύξηση των όγκων, μια διαδικασία που εμφανίζεται να είναι κοινή για όλους τους τύπους όγκων. Αντίθετα από την παρούσα αντιμιτωτική θεραπεία των καρκίνων, η αντι- neotic θεραπεία δεν θα προκαλούσε ανεπιθύμητες παρενέργειες. Μια λογική υπόθεση θα μπορούσε να γίνει για την προέλευση και την πρόοδο των όγκων στις οποίες το neosis διαδραματίζει έναν σημαντικό ρόλο στην πολλαπλών βημάτων καρκινογένεση στους διαφορετικούς τύπους καρκίνων και να καθοριστούν οι καρκίνοι ως ενιαία ασθένεια του ανεξέλεγκτου neosis λόγω της αποτυχίας του ελέγχου των σημείων γήρανσης.[36]
Το εντερικό επιθήλιο είναι ένας αυτοανανεούμενος ιστός που αντιπροσωπεύει ένα μοναδικό μοντέλο για τη μελέτη των διασυνδεδεμένων κυψελοειδών διαδικασιών όπως ο πολλαπλασιασμός, η διαφοροποίηση, η μετανάστευση κυττάρων και η καρκινογένεση. Αν και τα βλαστικά κύτταρα του εντέρου ακόμα δεν έχουν χαρακτηριστεί φυσικά ή και δεν έχουν απομονωθεί, τα στοιχεία κατά τη διάρκεια της προηγούμενης δεκαετίας έχουν εμπλέξει έντονα το μονοπάτι του Wnt/ βήτα catenin σήματος στη συντήρησή τους και την πρόοδο στον καρκίνο. Είναι προς μελέτη τα διαφοροποιητικά χαρακτηριστικά του εντερικού επιθηλίου σε σχέση με τη λειτουργία των βλαστικών κυττάρων, για να επεξηγηθούν οι σημαντικότερες γενετικές τροποποιήσεις που μπορούν να οδηγήσουν στον καρκίνο, και και να αποδειχθεί πώς η Wnt/ βήτα catenin σηματοδότηση ελέγχει την ομοιόσταση σε αυτόν τον ιστό.[37]
Στα stem cells του μεσεγχύματος (MSC) έχει δώθει μεγάλη προσοχή στον τομέα της μεταμόσχευσης των αιματοποιητικών stem cells επειδή όχι μόνο υποστηρίζουν την αιμοποίηση αλλά και παρουσιάζουν μια σημαντική ανοσοκατασταλτική δραστηριότητα που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να αποτρέψει την ανεπιθύμητη αλλοαντιδραστικότητα. Η ανοσοκατασταλτική δραστηριότητα ασκείται κυρίως στο επίπεδο του πολλαπλασιασμού των T-κυττάρων. Τα Msc εμφανίζουν μια παρόμοια αντιπολλαπλασιαστική δραστηριότητα στα κύτταρα όγκων αιματοποιητικής και μη αιματοποιητική προέλευσης. In vitro, τα MSC παρήγαγαν μιά παροδική διακοπή των καρκινικών κυττάρων στη G1 φάση του κυτταρικού κύκλου. Αυτό συνοδεύθηκε από μια μείωση του αποπτωτικού ποσοστού ακόμα και όταν περιορίζοταν οι παράγοντες επιβίωσης. Εντούτοις, όταν εγχύθηκαν καρκινικά κύτταρα σε μη-παχύσαρκο διαβητικό –από ανοσοκατεσταλμένα ποντίκια συνδυασμένα από κοινού με ΤΑ MSC, η αύξησή τους ήταν πολύ γρηγορότερη σε σύγκριση με την ομάδα που λάμβανε μόνο τα καρκινικά κύτταρα. Για να εξηγηθεί η απόκλιση μεταξύ της in vitro και in vivo συμπεριφοράς, προτείνεται ότι αυτά τα MSC έχουν τη δυνατότητα να διαμορφώσουν έναν καρκίνο κατάλληλων stem cells σε όποια τα καρκινικά κύτταρα μπορούν να συντηρήσουν τη δυνατότητα να πολλαπλασιαστούν και να στηριξουν την κακοήθη διαδικασία. Η κλινική χρήση λοιπόν των MSC στις συνθήκες στις οποίες μια κακοήθης ασθένεια περιλαμβάνεται πρέπει να αντιμετωπιστεί με ιδιαίτερη προσοχή.
Οι ποιοτικές και ποσοτικές επιδράσεις της γήρανσης πάνω στα stem cells δεν έχουν κατανοηθεί ικανοποιητικά, αν και πιστεύεται ότι τα stem cells από νεώτερο δότη θα πρέπει να έχουν μεγαλύτερο δυναμικό. Έτσι, πολλοί ερευνητές προτείνουν τα εμβρυϊκά stem cells που μπορούν να έχουν ένα πλεονέκτημα σε σχέση με τα stem cells ενηλίκων πάνω στις θεραπείες κυτταρικής αντικατάστασης. Όλα τα stem cells επενδύουν αρκετά σε μηχανισμούς αυτοπροστασίας και μπορούν να αναγεννηθούν, αλλά το εάν ή όχι μπορούν να ξεπεράσουν τη διάρκεια ζωής του ατόμου, αποτελεί αντικείμενο πολλών συζητήσεων. Από την άλλη μεριά, παραμένουν βιώσιμα στη διάρκεια ζωής ενός θηλαστικού, μικροί αριθμοί μπορούν να επαναποικίσουν ολόκληρο το θηλαστικό και πολλές ανίατες ασθένειες έχουν μηχανισμούς που δεν περιλαμβάνουν stem cells. Από την άλλη μεριά, τα περισσότερα stem cells, συμπεριλαμβανομένου αυτών από εμβρυϊκούς και ενήλικους ιστούς, δεν είναι αθάνατα και δείχνουν μια αύξηση αποπτωτικών μηχανισμών με την ηλικία Υπάρχουν μερικά δεδομένα από μοντέλα ποντικών, που δείχνουν ότι η αποτελεσματικότητα εποικισμού των παλαιότερων ΗSC, είναι μικρότερη από αυτήν των νεότερων ΗSC, και ότι τα ενήλικα stem cells, βρίσκονται σε συναγωνιστικό μειονέκτημα όταν μεταμοσχεύονται με εμβρυϊκά κύτταρα Παλαιότερα ΗSC παρουσιάζουν ελαττωμένη ικανότητα αυτό-πολλαπλασιασμου, μικρότερο δυναμικό ανάπτυξης και παράγουν μειωμένο αριθμό απογόνων όταν υπόκεινται σε απαιτήσεις για αιμοτιοίηση, και αυτή η ελάττωση στη λειτουργία είναι ακόμη πιο φανερή, όταν παλαιότερα δίειτι οεΐΐε υφίστανται αυξημένο stress. Όμοιες ποιοτικές επιδράσεις της γήρανσης συναντούνται με ΜSC. Στρώμα από παλαιότερο οστικό μυελό αμβλύνει τις αιμοποιητικές απαντήσεις μετά από μεταμόσχευση και αυξάνει την μετα-μοσχευτική αυτό-ανοσία.
Τα περισσότερα αν όχι όλα τα stem cells, παράγουν τελομεράση, που επιμηκύνει τα τελομερή, προστατεύει από γονιδιο-τοξική βλάβη και συσχετίζεται με κυτταρική αθανασία. Η αυτό-ανανέωση και το δυναμικό αναπαραγωγής των stem cells, πιθανώς εξαρτάται από την ικανότητα της τελομεράσης να διατηρήσει σταθερά τελομερή και σαν ένδειξη αναφέρεται ότι το μήκος των τελομερών αποτελεί το βιολογικό δείκτη της αναπαραγωγικής ιστορίας των κυττάρων. Κύτταρα από τη στελεχιαία σειρά (germline) έχουν πολύ μακριά τελομερή, που δεν κοντένουν με τη γήρανση των οργανισμών και εμβρυϊκά stem cells αναμένεται να έχουν πλεονέκτημα σε σχέση με ενήλικα stem cells από αυτήν τη ματιά. Συγκριτικές μελέτες από εμβρυϊκό ήπαρ και ΗSC από ενήλικο οστικό μυελό, έχουν επιβεβαιώσει ότι τα ΗSC εμβρυϊκού ήπατος έχουν υψηλότερη δραστηριότητα τελομεράσης και τα. ΗSC από οστικό μυελό έχουν κοντύτερα τελομερή, που ακόμη μια φορά δηλώνει ότι το δυναμικό πολλαπλασιασμού των HSC είναι περιορισμένο και ελλαττώνεται με την πάροδο της ηλικίας. [15]
Προκλήσεις για το μέλλον
Οι κύριες προκλήσεις που μένουν να ξεπερασθούν πριν τα εμβρυϊκά stem cells εφαρμοσθούν σε ανθρώπινη νόσο, περιλαμβάνουν τη γέννηση μεγάλων αριθμών επιθυμητών κυτταρικών τύπων σε καθαρή μορφή, ηθικές επιφυλάξεις αναφορικά με τη συλλογή και τη χρήση αμβλωτικών ιστών, έλεγχος της αποβολής από το ανοσοποιητικό σύστημα του ξενιστή, κατανόηση του κυτταρικού τύπου που απαιτείται για να διορθωθεί μια συγκεκριμένη παθολογία και του τρόπου διοχέτευσης του για μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα.
Αν και μερικά παραδείγματα της θεραπευτικής χρήσης εμβρυϊκών stem cells έχουν αναφερθεί σε ασθένειες ανθρώπων και ζώων, ένας αριθμός ερωτηματικών σχετιζόμενου ν με τη βιολογία των εμβρυικών stem cells παραμένει αναπάντητος. Είναι τα stem cells που προκύπτουν από διαφορετικές πηγές εμβρυϊκού αίματος ή ιστού λειτουργικά παρόμοια. Τα εμβρυϊκά stem cells, έχουν πραγματικά μεγαλύτερο δυναμικό ανάπτυξης από τους ομολόγους τους στον ιστό ενηλίκου; Τα εμβρυϊκά ΜSC έχουν μοναδικές ανοσοτροποποιητικές ιδιότητες συγκρινόμενα με τα ΜSC από ενήλικα και είναι λιγότερο ευπαθή στη γήρανση ή στην απόπτωση; Είναι τα διαφορετικά επίπεδα γονιδιακής έκφρασης ανάμεσα σε εμβρυϊκό μυελό των οστών και ήπαρ. ειδικά στα γονίδια εκείνα που σχετίζονται στενά με αιμοποιηση, η μοριακή βάση για την ερμηνεία του γεγονότος ότι διαφορετικά ΗSC από διαφορετικούς ιστούς, φέρουν διαφορετικά χαρακτηριστικά; Επιπρόσθετα, υπάρχουν διαφορετικές διαστάσεις της αλληλεπίδρασης stem cells - ιστού ξενιστή, που πρέπει να συζητηθούν: Ποιοι είναι οι μηχανισμοί εγκατάστασης που οδηγούν τα stem cells στην περιοχή βλάβης μετά από μεταμόσχευση; Τι ελέγχει τη διαφοροποίηση των εμφυτεύσιμων κυττάρων και οδηγεί τοπικούς παράγοντες σε δράση; Τελικά η χρησιμοποίηση εμβρυϊκών ιστών για οποιαδήποτε εφαρμογή δεν είναι ευρέως αποδεκτή και αποτελεί ακόμη αντικείμενο διαφωνιών Μερικές ερευνητικές ομάδες έχουν εκφράσει ανησυχία ότι τα προγράμματα ανάκτησης εμβρυϊκού ιστού, παρουσιάζουν υψηλούς κινδύνους λοίμωξης και η κλινική πρακτική της χρήσης εμβρυϊκού ιστού συχνά εμποδίζεται από περιορισμένη διαθεσιμότητα και ηθικούς προβληματισμούς.
Συμπερασματικά, τα εμβρυϊκά stem cells είναι πιο αρχέγονα από τα ενήλικα stem cells και έχουν μεγαλύτερο δυναμικό διαφοροποίησης. Τα εμβρυϊκά stem cells έχουν επίσης ένα πλεονέκτημα εμφύτευσης σε σχέση με κύτταρα από ενήλικες, εφόσον οι εμβρυϊκοί δέκτες είναι περισσότερο δεκτικοί για μοσχεύματα αλλογενών δωρητών από τους ενήλικες λήπτες. Οι μελέτες τώρα εστιάζουν στον καθορισμό του μηχανισμού της εμφύτευσης, εγκατάστασης και in vivo διαφοροποίησης των εμβρυϊκών stem cells, όπως επίσης και στην επιβεβαίωση των προτεινόμενων ανοσολογικών και αναπαραγωγικών πλεονεκτημάτων τους, σε σχέση με stem cells από ιστό ενήλικα. Κάποια εμβρυϊκά stem cells μπορούν να εξελιχθούν για να γίνουν σχεδόν τόσο τροποποιήσιμα, όσο τα κύτταρα ΕS και το δυνατόν χρήσιμα στην αναγεννησιακή ιατρική. Καινούργιες θεραπευτικές προσεγγίσεις, όπως η ενδομήτρια μεταμόσχευση εμβρυϊκών stem cells για ex vivo γονιδιακή θεραπεία, είναι πιθανά εφαρμόσιμες σε ένα μεγάλο φάσμα γενετικών παθήσεων, προ και μετά του τοκετού.[15]
1.Becker AJ, McCulloch EA, Till JE (1963). "Cytological demonstration of the clonal nature of spleen colonies derived from transplanted mouse marrow cells". Nature 197: 452-4. PMID 13970094.
2.Siminovitch L, McCulloch EA, Till JE (1963). "The distribution of colony-forming cells among spleen colonies". Journal of Cellular and Comparative Physiology 62: 327-36. PMID 14086156.
3.Tuch B (2006). "Stem cells--a clinical update.". Aust Fam Physician 35 (9): 719-21. PMID 16969445.
4.Friedenstein AJ, Deriglasova UF, Kulagina NN, Panasuk AF, Rudakowa SF, Luria EA, Ruadkow IA (1974). "Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method". Exp Hematol 2 (2): 83-92. PMID 4455512.
5.Friedenstein AJ, Gorskaja JF, Kulagina NN (1976). "Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs". Exp Hematol 4 (5): 267-74. PMID 976387.
6.Gardner RL (2002). "Stem cells: potency, plasticity and public perception". Journal of Anatomy 200 (3): 277-82. PMID 12033732.
7.Xie T, Spradling A (1998). "decapentaplegic is essential for the maintenance and division of germline stem cells in the Drosophila ovary.". Cell 94 (2): 251-60. PMID 9695953.
8.Song X, Zhu C, Doan C, Xie T (2002). "Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches.". Science 296 (5574): 1855-7. PMID 12052957.
9.Takahashi K, Yamanaka S (2006). "Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors". Cell 126 (4): 663-76. PMID 16904174.
10.Gahrton G, Björkstrand B (2000). "Progress in haematopoietic stem cell transplantation for multiple myeloma". J Intern Med 248 (3): 185-201. PMID 10971785.
11.Lindvall O (2003). "Stem cells for cell therapy in Parkinson's disease". Pharmacol Res 47 (4): 279-87. PMID 12644384.
12.Goldman S, Windrem M (2006). "Cell replacement therapy in neurological disease". Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 361 (1473): 1463-75. PMID 16939969.
13.Wade N (2006-08-14). Some Scientists See Shift in Stem Cell Hopes. New York Times. Retrieved on 2006-12-28.
14.Shostak S (2006). "(Re)defining stem cells". Bioessays 28 (3): 301-8. PMID 16479584
[β] http://www.brown.edu/Courses/BI0032/adltstem/adult-stem-cell.gif
[γ]http://www.stemcellresearchfoundation.org/Medical_Illustrations/MultipotentStemCells.jpg
[δ] http://www.scienceinafrica.co.za/pics/10_2003/stem2.jpg
[ε] http://www.sciencecases.org/stem_cells/Stem_cell_embryo_20x_01.jpg
[στ] http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/150/devel/c7.21.9.stem.cells.jpg
[ζ]http://content.answers.com/main/content/wp/en/thumb/a/af/400px-StemCellsDia.png
[η] Munsie MJ, Michalska AE, O'Brien CM, Trounson AO, Pera MF, Mountford PS, Isolation of pluripotent embryonic stem cells from reprogrammed adult mouse somatic cell nuclei, Monash Institute of Reproduction and Development, Monash University, Clayton, Victoria, Australia, PMID: 10985386.
[θ] http://tovima.dolnet.gr/print_article.php?e=B&f=14711&m=H01&aa=1
[ι] David A. Prentice, PhD, Testimony before the House Government Reform Subcommittee on Criminal Justice, Drug Policy and Human Resources, July 17, 2001. http://www.stemcellresearch.org/testimony/prentice3.htm
[κ] Bhatt RI, Brown MD, Hart CA, Gilmore P, Ramani VA, George NJ, Clarke NW, Novel method for the isolation and characterisation of the putative prostatic stem cell, Genito-Urinary Cancer Research Group, Cancer Research UK Paterson Institute for Cancer Research, Christie Hospital NHS Trust, Manchester, UK, PMID: 12879455.
[μ] Cbr Systems, Inc. (2006). Common Misconceptions About Cord Blood Banking. Cord Blood Registry. Retrieved on September 20, 2006.
[ν] NIH data
[ο] Raymer, Elizabeth (October 14, 2005). New strategy will boost cord blood stem cells. University of Toronto. Retrieved on September 20, 2006.
[ρ] http://en.wikipedia.org/wiki/Cord_blood
[σ] http://www.liaison.com.gr/i/gr/diseases.php
[τ] http://www.lifecord.gr/video.asp
[φ] Pinto D, Clevers H., Wnt, stem cells and cancer in the intestine, Hubrecht Laboratory, Netherlands Institute for Developmental Biology, 3584 CT Utrecht, The Netherlands, PMID: 15715524
[χ] Rajaraman R, Guernsey DL, Rajaraman MM, Rajaraman SR., Stem cells, senescence, neosis and self-renewal in cancer, Department of Medicine, Division of Hematology, Dalhousie University, Halifax NS, B3H 1X5. R.Rajaraman@Dal.Ca., PMID: 17092342
[ω] http://www.in.gr/innews/clones/clones04.htm
[ω1] Στεφανίδης Κ., Εμβρυϊκά Stem Cells, Σεμινάρια Α’ Μαιευτικής – Γυναικολογικής Κλινικής Παν/μίου Αθηνών, Νοσοκ. «Αλεξάνδρα».
16. Ποια είναι τα κυριότερα στάδια της ωρίμανσης του mRNA και ποιος ο φυσικός τους ρόλος;
Να γίνει και σχέδιο μαθήματος σε μαθητές Β' και Γ' λυκείου.
O πρωταρχικός ρόλος του γονιδιώματος είναι να προδιαγράφει RNA μόρια. Συγκεκριμένες αλληλουχίες του DNA μεταγράφονται προς RNA αλληλουχίες οι οποίες κωδικοποιούνται σε πρωτεΐνες (εάν συντίθεται mRNA) ή σε “δομικά” RNA όπως το tRNA ή το rRNA. Kάθε περιοχή της DNA διπλής έλικας που κωδικοποιείται προς λειτουργικό RNA μόριο αποτελεί ένα γονίδιο. Στους προκαρυωτικούς οργανισμούς το μεγαλύτερο μέρος του DNA κωδικοποιεί αλληλουχίες RNA. Αντίθετα στους πολυκύτταρους οργανισμούς το μεγαλύτερο μέρος του DNA δεν δείχνει να έχει κωδικοποιητική λειτουργία. Στην Drosophila μόνο το 5% του ολικού DNA κωδικοποιεί αλληλουχίες που μεταγράφονται σε RNA μόρια και στον άνθρωπο το ποσοστό αυτό είναι μικρότερο. Έτσι τα διάφορα γονίδια βρίσκονται διασκορπισμένα μέσα σε “όχι γονιδιακό” DNA.[1]
Στους ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς το μέγεθος των γονιδίων ξεπερνά τα 100.000 bp, μάλιστα μερικά γονίδια περιέχουν παραπάνω από 2.000.000 bp ωστόσο περίπου 1.000 bp είναι απαραίτητα για την κωδικοποίηση μίας πρωτεΐνης μεσαίου μεγέθους (300-400 αμινοξέα). Οι περισσότερες από αυτές τις επιπλέον αλληλουχίες σχηματίζουν μεγάλου μήκους περιοχές οι οποίες δεν κωδικοποιούνται και παρεμβάλλονται μεταξύ των μικρών περιοχών που κωδικοποιούνται. Οι αλληλουχίες που κωδικοποιούνται ονομάζονται εξώνια (exons) ενώ οι περιοχές που δεν κωδικοποιούνται ονομάζονται εσώνια (introns). Με άλλα λόγια τα γονίδια είναι κατατμημένα (split genes)(Εικόνα 1) [1]
Εικόνα 1 Η οργάνωση των γονιδίων σε ένα χαρακτηριστικό χρωμόσωμα σπονδυλωτού. Οι πρωτεϊνες που συνδέονται στο DNA στις ρυθμιστικές περιοχές καθορίζουν εάν ένα γονίδιο μεταγράφεται αν και βρίσκεται συχνά στο
Η µετάφραση της γενετικής πληροφορίας γίνεται στα ριβοσώµατα. Στους προκαρυωτικούς οργανισµούς, όπου δεν υπάρχει πυρηνική µεµβράνη, η µετάφραση αρχίζει πριν τη λήξη της µεταγραφής. Στους ευκαρυωτικούς, όµως, οργανισµούς το αρχικό µεταγράφηµα (pre mRΝΑ) υπόκειται, πριν περάσει στο κυτταρόπλασµα να µεταφραστεί, σε ωρίµανση. Η ωρίµανση περιλαµβάνει την αποµάκρυνση των εσωνίων (introns), την οργάνωση της καλύπτρας (cap) του
Λόγω κυρίως των εσωνίων που υπάρχουν στα ευκαρυωτικά μεταγραφήματα, το μέγεθος των πρωτογενών μεταγραφημάτων είναι κατά κανόνα πολύ πιο μεγάλο στα ευκαρυωτικά παρά στα προκαρυωτικά κύτταρα. Το μεγαλύτερο γνωστό ευκαρυωτικό γονίδιο περιέχει 2,5 εκατομμύρια ζεύγη βάσεων. Ενώ γίνεται η σύνθεση του μεταγραφήματος, αρχίζουν και γίνονται διάφορες τροποποιήσεις στο μόριο. Έτσι, στο 5' άκρο συνδέεται ανάποδα, δηλ. μέσω ενός ασυνήθιστου 5'à5' πυροφωσφορικού δεσμού, ένα μεθυλιωμένο νουκλεοτίδιο της γουανίνης, γνωστό ως cap (Εικόνα 2 ). Το νουκλεοτίδιο αυτό διατηρείται και στο τελικό μόριο mRΝΑ και είναι απαραίτητο προκειμένου το mRΝΑ:
· να περάσει από τους πόρους της πυρηνικής μεμβράνης κατά τη μετάβαση του στο κυτταρόπλασμα, όπου και κάνει τη δουλειά του.
· να δεσμευτεί στο ριβόσωμα, και
· να προστατευθεί από υδρολυτική αποικοδόμηση από το 5' άκρο.
Σε ορισμένα γονίδια αρχίζει το μάτισμα του μεταγραφήματος, πριν ολοκληρωθεί η σύνθεση του.
Μία ακόμα μετα-μεταγραφική τροποποίηση που παρατηρείται στα μεταγραφήματα της πολυμεράσης II είναι η μεθυλίωση των μορίων σε ορισμένες αδενίνες. Δεν γνωρίζουμε μέχρι σήμερα το σκοπό που εξυπηρετούν τέτοιες μεθυλιώσεις.
Ο τερματισμός της μεταγραφής γίνεται σε απόσταση αρκετών χιλιάδων ζευγών βάσεων από το 3' άκρο του ώριμου mRΝΑ. Το επί- πλέον κομμάτι απομακρύνεται υδρολυτικά και ακολουθείται από πολυαδενυλίωση, δηλ. από προσθήκη 200 περίπου αδενυλικών νουκλεοτιδίων, με αποτέλεσμα όλα σχεδόν τα μόρια mRΝΑ να καταλήγουν στο 3' άκρο σε μια πολυ-Α ουρά. Για την προσθήκη των αδενυλικών υπάρχει ειδική πολυμεράση, η οποία αναγνωρίζει ως υπόστρωμα μόνο το ΑΤΡ και δεν χρειάζεται εκμαγείο προκειμένου να δράσει. Σε ανώτερους οργανισμούς η προσθήκη της ουράς γίνεται περί τα 30 νουκλεοτίδια καθοδικά από την αλληλουχία ΑΑUΑΑΑ, η οποία είναι πολύ συντηρημένη κατά την εξέλιξη. Η τροποποίηση αυτή δεν είναι απαραίτητη για τη μετάφραση του mRΝΑ. Φαίνεται ότι συμβάλλει στη σταθεροποίηση του μορίου.[3]
Η πρώτη τροποποίηση στο mRNA στους ευκαρυώτες είναι η προσθήκη της 5′ cap, η οποία συνίσταται σε τέσσερα βήματα:- διάσπαση Pi στό τέλος του pre-mRNA μεταγραφήματος από την φωσφατάση, μετά η γουανύλ-τρανφεράση χρησιμοποιεί GTP στην τελευταία γουανοσίνη στο τέλος του (χρησιμοποιώντας έναν ασυνήθιστο 5΄ σε 5΄ δεσμό). Η γουανοσίνη μετά-μεθυλιώνεται στο 7΄ και καμμία έως πολλές ριβόζες στο 5΄ μπορούν ακόμη να μεθυλιωθούν καλά.(Εικόνα 2)
Εικόνα 2 [4]
Το Capping εμφανίζεται μόνο στο mRNA. Ανασυνδυαζόμενες θέσεις σε έναν υποκινητή RNA πολυμεράσης II αλλά και μια αλληλουχία RNA πολυμεράσης I η III έχει υποστεί capping, ως εκ τούτου το capping εκτελείται από παράγοντες συνδεμένους μόνο με RNA πολυμεράση II.
Το cap συνδεδεμένο πρωτεϊνικό σύμπλεγμα (CBC) συνδέει το cap: που χρειάζεται όταν το mRNA εξέρχεται από τον πυρήνα. (Εικόνα 3)
Εικόνα 3 [4]
Ο ρόλος του 5′ cap είναι να δεσμεύεται από τη μικρή υπομονάδα του ριβοσώματος. Αποτρέπει επίσης υποβάθμιση του pre-mRNA στον πυρήνα. Στους ανθρώπους (αλλά όχι στις ζύμες) η RNA πολυμεράση που οδηγεί τη μεταγραφή μετά τον αρχικό μεταγράφημα θα διασπαστεί. Χωρίς το cap, αυτή υποβαθμίζεται, και τελικά η πολυμεράση ολοκληρώνει-τερματίζει τη δράση της. (Εικόνα 4)
Εικόνα 4 [4]
Η poly-A ουρά που προστίθεται σχεδόν σε όλα τα mRNAs προστίθεται μετα-μεταγραφικά: δεν κωδικοποιείται το ίδιο στο γονίδιο. Το pre-mRNA μεταγράφημα έχει μια AAUAAA ακολουθία που αναγνωρίζεται από τον CPSF (ιδιόμορφο παράγοντα διάσπασης και πολυαδενυλίωσης) και μια CA ακολουθία που είναι μια θέση σύνδεσης ενδονουκλεάσης.
5′ c.20 nt 3′
5′---AAUAAA---CA---{GU}n---3′
Η poly-A η ουρά προστίθεται σε δύο κύρια βήματα: Το AAUAAA δεσμεύεται με διάσπαση και πολυαδενυλίωση από τον ιδιόμορφου παράγοντα (CPSF), ο οποίος στρατολογεί τον παράγοντα διάσπασης F. Η CStF ενδονουκλεάση διασπά το μεταγράφημα στη CA θέση. Η Poly-A πολυμεράση μετά προσθέτει~ 200 κατάλοιπα αδενοσύνης, τα οποία συνδέονται με poly-A συνδεόμενες πρωτεϊνες.(Εικόνα 5)
Εικόνα 5 [4]
Η ουρά απαιτείται για την εξαγωγή μέσω των πυρηνικών πόρων, και αποτρέπει υποβάθμιση στο κυτταρόπλασμα (ο χρόνος ημιζωής της poly-A mRNA είναι ~ 10 ώρες).[4]
Το RΝΑ που συνθέτεται πάντα βρίσκεται συμπλοκοποιημένο με πρωτεΐνες. Θα ήταν επικίνδυνο το μεταγραφή μα να παραμείνει για πολλή ώρα «γυμνό», μια και μέσα στον πυρήνα υπάρχουν άφθονα ένζυμα που υδρολύουν το RΝΑ, και τα οποία βέβαια χρειάζονται για το μεταβολισμό των περιοχών εκείνων των μεταγραφημάτων που δεν περιέχουν πληροφορία. Αυτός θα φανταζόμασταν ότι είναι ένας σημαντικός λόγος γιατί το μεταγράφημα συμπλοκοποιείται καθώς συνθέτεται με ένα μεγάλο αριθμό πρωτεϊνών. Ένας άλλος λόγος θα ήταν να αποτρέπεται η ανάπτυξη ενδομοριακών δεσμών υδρογόνου, προκειμένου το RΝΑ να μπορεί να υφίσταται τις διάφορες μετα-μεταγραφικές τροποποιήσεις. Τα σύμπλοκα που προκύπτουν ονομάζονται ετερογενείς νουκλεοπρωτεΐνες του πυρήνα Η πιο σημαντική μετα-μεταγραφική τροποποίηση στα μεταγραφήματα της πολυμεράσης II του RΝΑ είναι το μάτισμα. Όπως αναφέραμε πολλές φορές μέχρι τώρα, τα ευκαρυωτικά γονίδια που κωδικεύουν πρωτεΐνες είναι ασυνεχή δηλ. παρεμβάλλονται στις κωδικεύουσες αλληλουχίες (εξώνια) και αλληλουχίες που κατά κανόνα δεν περιέχουν πληροφορία (εσώνια). Τα εσώνια κυμαίνονται σε μέγεθος από λίγες δεκάδες μέχρι 20000 ζεύγη βάσεων. Με δεδομένο ότι τα εξώνια αποτελούνται κατά μέσο όρο χονδρικά από 1500 περίπου ζεύγη βάσεων, είναι φανερό ότι τα τελικά μόρια mRΝΑ θα είναι πιο μικρά και πολλές φορές πολύ πιο μικρά από τα αντίστοιχα πρωτογενή μεταγραφήματα. Το σχήμα 4.6 αποδίδει περιγραφικά τη σχέση μεγέθους ενός μεταγραφήματος με το αντίστοιχο μόριο mRΝΑ. Η αφαίρεση των εσωνίων από το μεταγράφημα καλείται μάτισμα και στους περισσότερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς γίνεται από ειδικά σωμάτια ματίσματος Τα σωμάτια αυτά είναι ριβονουκλεοπρωτεΐνικά σύμπλοκα μεγέθους 40-608, που συγκροτούνται κατά τη διάρκεια σύνθεσης του μεταγραφήματος. Αποτελούνται από μικρές πυρηνικές ριβονουκλεοπρωτεΐνες η κάθε μία από τις οποίες περιέχει 10-20 πρωτεΐνες και ένα ή δύο μόρια μικρών πυρηνικών RΝΑ (snRΝΑs), γνωστών και ως U-RΝΑs. Τα μόρια αυτά αποτελούνται από λίγες δεκάδες έως 200 περίπου βάσεις, όπως ήδη αναφέραμε. Εκτός από τα snRΝΑs τα σωμάτια ματίσματος περιέχουν και διάφορους παράγοντες ματίσματος. Υπάρχουν ειδικές αλληλουχίες με τις οποίες αρχίζουν και τελειώνουν τα εσώνια. Έτσι, όλα σχεδόν τα εσώνια στο 5' άκρο τους αρχίζουν με GU και στο 3' άκρο τους τελειώνουν με ΑG. Οι αλληλουχίες αυτές αναγνωρίζονται από τα snRΝPs, και με αντιδράσεις τρανσεστεροποίησης (που δεν χρειάζεται να μας απασχολήσουν) αφαιρούνται τα εσώνια και συνδέονται τα εξώνια. Ένα κρίσιμο σημείο στη διαδικασία του ματίσματος είναι και η σειρά με την οποία αφαιρούνται τα εσώνια και συνδέονται τα εξώνια. Έχουν παρατηρηθεί και περιπτώσεις εναλλακτικού ματίσματος που οφείλονται σε διάφορους λόγους, όπως π.χ. σε μεταλλάξεις των γονιδίων σε κρίσιμες περιοχές, όπως οι αλληλουχίες GU και ΑG που αναφέραμε πιο πάνω. Ορισμένες μάλιστα από αυτές τις περιπτώσεις οδηγούν και σε παθολογικές καταστάσεις στον άνθρωπο. Η Εικόνα 6 αναπαριστάνει τη δομή ενός ώριμου μορίου mRΝΑ.[3]
Εικόνα 6 [3]
Πριν κλείσουμε το θέμα της ωρίμανσης του mRΝΑ, πρέπει να αναφερθούμε συνοπτικά και σε μια ενδιαφέρουσα διεργασία που υφίστανται τα πρόδρομα μόρια mRΝΑ οργανιδίων κυρίως, δηλ. μιτοχονδρίων και χλωροπλαστών (τα οποία όπως γνωρίζουμε έχουν το δικό τους DΝΑ και ως εκ τούτου και τους δικούς τους μηχανισμούς γονιδιακής έκφρασης), και πολύ σπάνια του πυρήνα. Οι Αγγλοσάξονες ονομάζουν τη διεργασία editing (διόρθωση κειμένου) και αφορά τη μετατροπή μιας βάσης σε άλλη (π.χ C—>U ή Α—>G) ή την παρεμβολή κάποιου νέου νουκλεοτιδίου ή την αφαίρεση κάποιου άλλου ή ακόμα και ενός μικρού αριθμού συνεχών νουκλεοτιδίων. Είναι φανερό ότι τέτοιου είδους τροποποιήσεις μεταβάλλουν και την πληροφορία του mRΝΑ. Όπως γνωρίζουμε από το γενετικό κώδικα, αλληλουχίες τριών συγκεκριμένων νουκλεοτιδίων (που ονομάζονται κωδικόνια) καθορίζουν την ενσωμάτωση συγκεκριμένων αμινοξέων στις πρωτεΐνες. Είναι φανερό ότι, αν αντικατασταθεί ένα νουκλεοτίδιο με ένα άλλο σε κάποιο κωδικόνιο, υπάρχει μεγάλη πιθανότητα να ενσωματωθεί στην πρωτεΐνη άλλο αμινοξύ, ή το κωδικόνιο να δίνει το σήμα τερματισμού της πρωτεΐνοσύνθεσης. Ακόμα πιο δραματικές επιπτώσεις θα έχουμε εάν παρεμβληθεί κάπου ένα νέο νουκλεοτίδιο ή αφαιρεθεί κάποιο άλλο. επειδή από εκεί και πέρα θα έχουμε μεταβολές σε όλα τα κωδικόνια. Για να επιβιώσει όμως κατά την εξέλιξη αυτή η διεργασία, σημαίνει ότι συνθέτονται προϊόντα χρήσιμα για τους οργανισμούς που την εφαρμόζουν. Πράγματι, στα θηλαστικά ο μηχανισμός αυτός είναι καθοριστικός για τις ιδιότητες ορισμένων καναλιών ιόντων και υποδοχέων που ελέγχονται από G-πρωτεΐνες.
Η πολυμεράση III του RΝΑ συνθέτει το 5S ριβοσωμικό RΝΑ, τα tΝΑ και τα snRΝΑ. Υπάρχουν αντίστοιχα τρεις κατηγορίες προαγωγών, οι οποίοι, βρίσκονται καθοδικά προς το σημείο έναρξης της μεταγραφής και ως εκ τούτου μεταγράφονται και εκείνοι στα προϊόντα. Η διαδικασία μεταγραφής ελέγχεται από έναν αριθμό γενικών παραγόντων μεταγραφής (ΤFΙΙΙΑ, Β, C κτλ.). Ο τερματισμός της μεταγραφής γίνεται κατά τρόπο ανάλογο με εκείνον της προκαρυωτικής πολυμεράσης του RΝΑ. Η σύνθεση δηλ. RΝΑ σταματά όταν το ένζυμο φτάσει σε μία περιοχή πλούσια σε αλληλουχίες GC, που την ακολουθούν περιοχές πολυουριδυλικού. Το 5S rRΝΑ αποτελεί απευθείας αντίγραφο του αντίστοιχου γονιδίου και το μεταγραφή μα δεν χρειάζεται παραπέρα επεξεργασία. Τα γονίδια, όμως, των μορίων tRΝΑ περιέχουν εσώνια τα οποία πρέπει να αποκοπούν. Η αποκοπή και η επακόλουθη ένωση των εξωνίων γίνεται ενζυμικά. Τα μόρια tRΝΑ, όπως γνωρίζουμε, τροποποιούνται εκτεταμένα σε ένα σημαντικό ποσοστό των βάσεων τους και έτσι προκύπτουν οι γνωστές σπάνιες βάσεις των μορίων αυτών. Αλλά και τα μόρια snRΝΑ τροποποιούνται κυρίως στις βάσεις ουρακίλης από τις οποίες έχουν άφθονες.[3]
Οι αλληλουχίες των βάσεων εκατοντάδων συνδέσεων εσωνίων-εξωνίων σε μόρια RNA έχουν γίνει γνωστές (Πίνακας 1)
Αυτές οι αλληλουχίες για τα ευκαρυωτικά κύτταρα, των οποίων οι πολυπλοκότητα εκτείνεται από ζυμομύκητες μέχρι τα θηλαστικά, εμφανίζουν κοινά δομικά χαρακτηριστικά, όπως : η αλληλουχία των βάσεων ενός εσωνίου αρχίζει με GU και τελειώνει με AG. Τα εσώνια επίσης περιέχουν μία σημαντική εσωτερική θέση η οποία βρίσκεται μεταξύ 20 και 50 νουκλεοτιδίων ανοδικά της θέσης διάσπασης (splice site) προς την 3΄ πλευρά. Η θέση αυτή ονομάζεται θέση διακλάδωσης (branch site). Στους ζυμομύκητες η αλληλουχία της θέσης διακλάδωσης σχεδόν πάντοτε είναι UACUAAC, ενώ αντίθετα στα θηλαστικά διαπιστώνεται μία ποικιλία ως προς την αλληλουχία αυτών των θέσεων: [1]
Πίνακας 1. Οι αλληλουχίες βάσεων συνδέσεων εσωνίων-εξωνίων
Περιοχή ενός γονιδίου Εξόνιο Ιντρόνιο Εξόνιο |
Ιντρόνιο 2 ωολευκωματίνης UAAGGUGAGC---------UUACAGGUUG |
Ιντρόνιο 3 ωολευκωματίνης UCAGGUACAG-------- AUUCAGUCUG |
Ιντρόνιο 1-σφαιρίνης β GCAGGUUGGU--------CCUUAGGCUG |
Ιντρόνιο 2- σφαιρίνης β CAGGGUGAGU---------CCACAGUCUC |
Ιντρόνιο 1 ανοσοσφαιρίνης λ1 UCAGGUCAGC-------- UUGCAGGGGC |
Πρώιμο αντιγόνο Τ του ιού SV40 UAAGGUAAAU--------UUUUAGAUUC |
[1]
Περιοχές των εσωνίων διαφορετικές από τις θέσεις διάσπασης 5΄ και 3΄ καθώς και τη θέση διακλάδωσης, φαίνεται πως δεν είναι σημαντικές για τον προσδιορισμό της θέσης όπου συμβαίνει η διάσπαση και η εξαγωγή του εσωνίου. Τα εσώνια ποικίλουν ως προς το μήκος τους από 50 έως 10.000 νουκλεοτίδια. Το μεγαλύτερο κομμάτι ενός εσωνίου μπορεί να αφαιρεθεί χωρίς να αλλάζει τη θέση ή την αποτελεσματικότητα της ωρίμανσης. Με τον ίδιο τρόπο, η ωρίμανση δεν επηρεάζεται από την εισαγωγή μεγάλων τμημάτων DNA εντός των εσωνίων των γονιδίων.
Επιπλέον, χιμαιρικά εσώνια τα οποία έχουν κατασκευαστεί με μεθόδους ανασυνδυασμένου DNA από το 5΄ άκρο ενός εσωνίου και από το 3΄ άκρο ενός άλλου, διαφορετικού εσωνίου, διασπώνται και εξάγονται κανονικά από πρόδρομα mRNA, δεδομένου ότι οι θέσεις ωρίμανσης και η θέση διακλάδωσης παραμένουν αναλλοίωτες.
Αντίθετα, μεταλλάξεις εντός οποιασδήποτε από αυτές τις περιοχές έχουν ως αποτέλεσμα ωρίμανση σε λάθος θέσεις (έκτροπη ωρίμανση). Μεταλλάξεις σε θέσεις μακρύτερα από τις περιοχές διάσπασης μπορούν να οδηγήσουν σε μη κανονική επανασύνδεση μόνον σε περίπτωση δημιουργίας μίας νέας περιοχής, που μοιάζει με την ομόφωνη αλληλουχία της 5΄ ή της 3΄ θέσης διάσπασης σε μία άλλη τοποθεσία.
Μερικοί τύποι θαλασσαιμίας (μίας ομάδας κληρονομικών ασθενειών του αίματος που διακρίνονται από τη μη φυσιολογική σύνθεση αιμοσφαιρίνης) προκαλούνται από έκτροπη ωρίμανση του mRNA της αιμοσφαιρίνης π.χ. μετάλλαξη μίας G σε Α, 19 νουκλεοτίδια μακριά από την κανονική θέση διάσπασης του πρώτου εσωνίου δημιουργεί μία νέα θέση διάσπασης.
Το mRNA που προκύπτει από αυτήν την μετάλλαξη περιέχει μία σειρά από κωδίκια τα οποία, φυσιολογικά, δεν θα έπρεπε να υπήρχαν. Το έκτο κωδίκιο μετά τη θέση διάσπασης αποτελεί σήμα τερματισμού της πρωτεϊνοσύνθεσης (UAG), με αποτέλεσμα η βιοσύνθεση της πρωτεΐνης που κωδικοποιείται από αυτό το mRNA να τερματίζει πριν από την ολοκλήρωσή της.[1]
Πως το 3΄-ΟΗ άκρο ενός εξωνίου του πρόδρομου μορίου mRNA συνδέεται με το 5΄-P άκρο του παρακείμενου εξωνίου; Η πορεία (Εικόνα 7) αυτή αρχίζει με τη διάσπαση του φωσφοδιεστερικού δεσμού μεταξύ του ανοδικού εξωνίου (εξώνιο 1) και του 5΄ άκρου του εσωνίου.
Εικόνα 7 Ο Μηχανισμός ματίσματος του πρόδρομου mRNA σε ευκαρυωτικό πυρήνα. Το ανοδικό
Η χημική ομάδα που προκαλεί αυτή τη διάσπαση είναι η 2΄-ΟΗ μίας Α η οποία βρίσκεται στη θέση διακλάδωσης.(Εικόνα 8) Ως αποτέλεσμα αυτής της αντίδρασης σχηματίζεται ένας φωσφοδιεστερικός δεσμός 2΄- 5΄ μεταξύ της Α και του 5΄ άκρου του εσωνίου. Επιπλέον η Α είναι συνδεμένη και με δύο άλλα νουκλεοτίδια μέσω φυσιολογικών φωσφοδιεστερικών δεσμών 3΄- 5΄.
Εικόνα 8 Δομή του σημείου διακλάδωσης στον ενδιάμεσο βρόγχο στο μάτισμα. Αυτό το αδενυλικό κατάλοιπο είναι συνδεδεμένο με 3 νουκλεοτίδια με φωσφοδιεστερικούς δεσμούς.
Η νέα
Επομένως, σε αυτή τη θέση δημιουργείται μία διακλάδωση, με συνέπεια τον σχηματισμό ενός ενδιάμεσου μορίου με δομή “λάσου”.
Το 3΄-ΟΗ άκρο του εξωνίου 1 στη συνέχεια προσβάλει τον φωσφοδιεστερικό δεσμό μεταξύ του εσωνίου και του εξωνίου 2. Τα εξώνια 1 και 2 ενώνονται ενώ το εσώνιο αποβάλλεται έχοντας δομή λάσου.
Η διάσπαση και επανασύνδεση επιτυγχάνεται με δύο αντιδράσεις τρανσεστεροποίησης και όχι με μία υδρόλυση η οποία ακολουθείται από νέα σύνθεση δεσμού. Η πρώτη αντίδραση δημιουργεί ένα ελεύθερο 3΄-ΟΗ άκρο στο άκρο του εξονίου1, ενώ η δεύτερη αντίδραση συνδέει αυτή την ομάδα με το 5΄-Ρ άκρο του εξωνίου 2. Ο αριθμός των φωσφοδιεστερικών δεσμών παραμένει ίδιος κατά τη διάρκεια αυτών των βημάτων. Μέχρις ότου ενωθούν τα δύο εξώνια, τα προϊόντα της πρώτης αντίδρασης συγκρατούνται μεταξύ τους σε ένα επανασυνδεόσωμα (spliceosome), το οποίο συνιστάται από ένα συγκρότημα ριβονουκλεοπρωτεϊνών, που αναγνωρίζουν και δεσμεύονται με τις θέσεις διάσπασης 5΄ και 3΄ και τη θέση διακλάδωσης πρόδρομων μορίων mRNA.[1]
Ο πυρήνας και το κυτταρόπλασμα περιέχουν πολλά είδη μικρών μορίων RNA που περιέχουν λιγότερα από 300 νουκλεοτίδια. Τα μικρά αυτά μόρια RNA ονομάζονται snRNA (small nuclear RNAs – μικρά πυρηνικά RNA) και scRNA (small cytoplasmic RNAs – μικρά κυτταροπλασματικά RNA). Τα μόρια των snRNA και scRNA συνδυάζονται με ειδικές πρωτεΐνες σχηματίζοντας σύμπλοκα τα οποία ονομάζονται snRNPs (small nuclear ribonucleoprotein practicles – μικρά σωμάτια πυρηνικής ριβονουκλεοπρωτεΐνης) και scRNPs (small cytoplasmic ribonucleoprotein practicles – μικρά σωμάτια κυτταροπλασματικής ριβονουκλεοπρωτεΐνης), πολλοί ερευνητές τα προφέρουν ως “snurps” και “scurps” αντίστοιχα. Τα επανασυνδεοσώματα είναι μεγάλα σύμπλοκα (60S), τα οποία περιέχουν πέντε είδη snRNPs μαζί με ένα πρόδρομο μόριο mRNA
Πίνακας 2.spliceosomes
SnRNP | Μέγεθος snRNA | Ρόλος |
U1 | 165 (νκλ) | Δεσμεύεται στη θέση διάσπασης 5΄ και μετά στην 3΄. |
U2 | 185 (νκλ) | Δεσμεύεται στη θέση διακλάδωσης και σχηματίζει μέρος του καταλυτικού κέντρου. |
U5 | 116 (νκλ) | Δεσμεύεται στη θέση διάσπασης 5΄. |
U4 | 145 (νκλ) | Καλύπτει την καταλυτική δράση του U6. |
U6 | 106 (νκλ) | Καταλύει την ωρίμανση. |
Ο ρόλος-κλειδί των snRNPs κατά την ωρίμανση άρχισε να διευκρινίζεται όταν βρέθηκε ότι αντισώματα (Ab) ειδικά για αυτές τις πρωτεΐνες εμπόδιζαν την ωρίμανση του RNA. Tα αντισώματα αυτά απομονώθηκαν από ασθενείς που υπέφεραν από συστηματικό ερυθηματώδη λύκο, ένα αυτοάνοσο νόσημα το οποίο χαρακτηρίζεται από τον σχηματισμό αντισωμάτων εναντίον πολλών πυρηνικών συστατικών. Οι αρθρώσεις αλλά και πολλά όργανα του σώματος επηρεάζονται σε αυτή τη νόσο (κυρίως τα νεφρά).
Σε κύτταρα θηλαστικών, η ωρίμανση αρχίζει με την αναγνώριση της 5΄ θέσης διάσπασης από την U1 snRNP.
Εικόνα 9 Μονοπάτι για την συγκρότηση του επανασυνδεοσώματος. Το U1 (μπλέ) συνδέεται στο
Αυτό επιτυγχάνεται με τη βοήθεια μίας αλληλουχίας που περιέχει το U1 RNA, η οποία είναι συμπληρωματική με την αλληλουχία της θέσης αυτής και επιπλέον, η δέσμευση του U1snRNP στη 5΄ θέση διάσπασης την προστατεύει από πέψεις:
Μετά το U1 δεσμεύεται το U2 snRNP στη θέση διακλάδωσης στο εσώνιο. Αυτή η δέσμευση του U1 και του U2 έχει σαν αποτέλεσμα να πλησιάσουν το 5΄ και το 3΄ του εσωνίου, μία δομή χάρη στην οποία το U1 μπορεί να δεσμευτεί και με το 3΄ άκρο του εσωνίου. Στο σύμπλοκο του U1 με το U2 και το πρόδρομο mRNA συνενώνεται και το προσχηματισμένο σύμπλοκο του U4-U5-U6 και έτσι σχηματίζεται ένα πλήρες επανασυνδεόσωμα (spliceosome)(Εικόνα 9).[1]
Πρώτα το U5 αλληλεπιδρά με τις αλληλουχίες του εξωνίου στην 5΄ θέση διάσπασης.
Το επόμενο βήμα είναι η κατευθυνόμενη από ΑΤΡ υδρόλυση των ζευγών βάσεων μεταξύ του U1 και της 5΄ θέσης διάσπασης.
Μετά το U1 φεύγει από το επανασυνδεόσωμα και το U5 επεκτείνει το σχηματισμό ζευγών με το πρόδρομο mRNA, έτσι ώστε να συμπεριλαμβάνει και την 5΄ θέση διάσπασης.
Μετά η διάσπαση των ζευγών μεταξύ των U4 και U6 έχει σαν αποτέλεσμα την απελευθέρωση της καταλυτικής δράσης του U6. To U4 λειτουργεί σαν καταστολέας ο οποίος καλύπτει το U6 μέχρις ότου ευθυγραμμιστούν οι κατάλληλες θέσεις ωρίμανσης.
Το U6 απελευθερωμένο από το U4 σχηματίζει ζεύγη με τις συντηρητικές αλληλουχίες του εσωνίου στην 5΄ θέση διάσπασης.
Επιπλέον το U6 σχηματίζει ζεύγη και με U2 το οποίο με τη σειρά του έχει σχηματισμένα ζεύγη με τη θέση διακλάδωσης του εσωνίου. Το U2 και το U6 snRNAs πιθανών σχηματίζουν το καταλυτικό κέντρο του επανασυνδεοσώματος. (Εικόνα 10)
Εικόνα 10 Το καταλυτικό κέντρο του επανασυνδεοσώματος σχηματίζεται από U2 sn RNA (κόκκινο) και U6 sn RNA (πράσινο) που είναι ζευγαρωμένα. Το U2 είναι επίσης ζευγαρωμένο με τη θέση διακλάδωσης του πρόδρομου mRNA.[5]
Η 2΄-ΟΗ ομάδα από το σημείο διακλάδωσης προσβάλει την 5΄ θέση διάσπασης και το νεοσύστατο 3΄-ΟΗ του εξωνίου 1 προσβάλει την 3΄ θέση διάσπασης προς την ένωση των δύο εξωνίων. Το U2, U5 και το U6 είναι δεσμευμένα στο αποκομμένο ιντρόνιο και τέλος απελευθερώνονται ολοκληρώνοντας την αντίδραση της ωρίμανσης.
Δύο χαρακτηριστικά αυτής διαδικασίας είναι αξιοσημείωτα : Πρώτον, τα RNA μόρια έχουν ρόλο κλειδί κατευθύνοντας την ευθυγράμμιση των θέσεων διάσπασης και φέροντας εις πέρας την κατάλυση. Δεύτερον, ΑΤΡ-κατευθυνόμενες πρωτεΐνες ξεδιπλώνουν τους δίκλωνους RNA ενδιάμεσους σχηματισμούς και επάγουν την απελευθέρωση των ριβονουκλεοπρωτεϊνών από τα RNA παράγωγα.[1]
Στα ευκαρυωτικά κύτταρα, όπως και στα προκαρυωτικά, τα rRNA μόρια σχηματίζονται μετά από τη διάσπαση πρωτογενών μεταγραφημάτων. Στο βλεφαριδωτό πρωτόζωο Tetrahymena, ένα εσώνιο 414 νουκλεοτιδίων αφαιρείται από ένα πρόδρομο μόριο, προκειμένου να προκύψει το ώριμο του 26S rRNA.(Εικόνα 11)
Εικόνα 11 Αυτομάτισμα του πρόδρομου ριβοσωμικού RNA της Tetrahymena. Ένα εσώνιο 414 νουκλεοτιδίων (κόκκινο) προκείπτει κατά τη διαδικασία του πρώτου ματίσματος, κατά την οποία η γουνοσίνη ή το νουκλεοτίδιο της γουανίνης (πράσινο) λειτουργεί σαν συμπαράγοντας. Αυτό το εσώνιο ματίζει τον εαυτό του 2 φορές ξανά για να παράγει ένα γραμμικό RNA που έχει χάσει συνολικά 19 νουκλεοτίδια. Αυτό το L19 RNA έχει καταλυτική δράση.[5]
Οι μελέτες του Thomas Cech και των συνεργατών του σε αυτήν την αντίδραση ωρίμανσης οδήγησαν σε μερικά εντελώς απροσδόκητα αποτελέσματα. Οι ερευνητές αυτοί πρόσθεσαν κυτταρικό εκχύλισμα σε πρόδρομα RNA μόρια ώστε να προσδιορίσουν τις πρωτεΐνες που απαιτούνταν για την αντίδραση της ωρίμανσης. Με έκπληξη τους βρήκαν ότι ένα δείγμα-μάρτυρας που περιείχε το πρόδρομο RNA μόριο και τριφωσφορικά νουκλεοτίδια, αλλά χωρίς την προφανή τουλάχιστον παρουσία πρωτεϊνών, υπέστη ωρίμανση. Σε αυτό το πείραμα υπήρχε η αμφιβολία ότι ήταν πιθανό να μην είχε απομακρυνθεί από το παρασκεύασμα μία ουσιώδης πρωτεΐνη, η οποία δρούσε καταλυτικά για την ανωτέρω αντίδραση. Αυτή η αμφιβολία διαλευκάνθηκε με τη χρήση των μεθόδων ανασυνδυασμένου DNA, βάσει των οποίων παρασκευάστηκε DNA που αντιστοιχούσε σε αυτό το πρόδρομο μόριο των 6,4 kb (κύτταρα Ε. coli που χρησιμοποιούνται ως ξενιστές για την κλωνοποίηση, δεν περιέχουν αυτό το πρόδρομο RNA μόριο).
Καθαρό DNA που κωδικοποιούσε το πρόδρομο RNA μόριο χρησιμοποιήθηκε σε πειράματα μεταγραφής in vitro για να παρασκευαστεί το συνθετικό πρόδρομο RNA μόριο, το οποίο στη συνέχεια θα χρησιμοποιείτο ως υπόστρωμα στην αντίδραση ωρίμανσης. Το αποτέλεσμα ήταν ακριβώς το ίδιο όπως προηγουμένως: Με την παρουσία νουκλεοτιδίων το RNA μπορούσε να ωριμάζει από μόνο του με τέτοια ακρίβεια ώστε να αφαιρεί επακριβώς το ιντρόνιο των 414 βάσεων. Αυτό το αξιοθαύμαστο πείραμα δείχνει ότι ένα μόριο RNA μπορεί να διαθέτει εξαιρετικά εξειδικευμένη δραστικότητα με αποτέλεσμα να ωριμάζει από μόνο του.
Αρχικά στο μείγμα της αντίδρασης προστέθηκαν νουκλεοτίδια, επειδή πίστευαν ότι ήταν δυνατόν να απαιτείτο ATP ή GTP ως πηγή ενέργειας. Απεδείχθη ότι ο συμπαράγοντας που απαιτείτο στην αντίδραση ήταν μία γουανοσίνη είτε ως απλή γουανοσίνη είτε με τη μορφή GMΡ, GDP ή GTP. Η G (με οποιαδήποτε από τις ανωτέρω μορφές) δεν χρησιμοποιείται ως πηγή ενέργειας, αλλά ως μία προσβάλλουσα χημική ομάδα, η οποία ενσωματώνεται μεταβατικά στο μόριο του RNA.[1]
Εικόνα 12 Ο ζητούμενος καταλυτικός μηχανισμός του αυτοματιζόμενου εσωνίου στη Tetrahymena.[5]
Η G δεσμεύεται με το RNA και στη συνέχεια προσβάλλει την 5΄ θέση διάσπασης σχηματίζοντας έναν φωσφοδιεστερικό δεσμό με το 5΄ άκρο του εσωνίου. Η αντίδραση τρανσεστεροποίησης δημιουργεί ένα 3΄-ΟΗ άκρο στο τέλος του ανοδικού εξωνίου.
Η 3΄ θέση διάσπασης προσβάλλεται στη συνέχεια από τη νεοσύστατη 3΄-ΟΗ ομάδα του ανοδικού εξωνίου. Αυτή η δεύτερη αντίδραση τρανσεστεροποίησης ενώνει τα δύο εξώνια και οδηγεί στην απελευθέρωση του εσωνίου των 414 νουκλεοτιδίων.(Εικόνα 12)
Στη συνέχεια συμβαίνουν ακόμη δύο κύκλοι αυτο-ωρίμανσης η 3΄-ΟΗ ομάδα του εσωνίου προσβάλει έναν φωσφοδιεστερικό δεσμό κοντά στο 5΄ άκρο σχηματίζοντας ένα κύκλο και ένα κομμάτι 15 νουκλεοτιδίων, το οποίο περιέχει το μόριο της G που είχε ενσωματωθεί κατά το πρώτο βήμα της πορείας αυτής. Το κυκλικό μόριο RNA των 399 νουκλεοτιδίων ανοίγει σχηματίζοντας ένα ευθύγραμμο μόριο, το οποίο κυκλοποιείται εκ νέου χάνοντας ένα κομμάτι 4 νουκλεοτιδίων. Τέλος, ο κύκλος αυτός ανοίγει σχηματίζοντας ένα ευθύγραμμο μόριο RNA, το οποίο ονομάζεται L-19 IVS ή αλλιώς L19 RNA.
Το L19 RNA είναι σταθερό διότι δεν έχουν απομείνει συμπληρωματικές αλληλουχίες πλούσιες σε πυριμιδίνες. Εν τούτοις το L19 RNA συνεχίζει να περιέχει μία θέση δέσμευσης G και μία αλληλουχία-οδηγό.
Επιπλέον το L19 RNA μπορεί να δρα σε εξωτερικά υποστρώματα. Πράγματι το L19 RNA καταλύει τη μετατροπή του πεντακυτιδυλικού (C5) τόσο σε κοντύτερα όσο και μακρύτερα πολυμερή. Επομένως, το L19 RNA είναι ένα πραγματικό ένζυμο: είναι και νουκλεάση και πολυμεράση. Ο ρυθμός της υδρόλυσης των C5 από αυτό το ριβόζυμο (ribozyme) είναι περίπου 1010 φορές μεγαλύτερος από τον ρυθμό της αντίδρασης χωρίς καταλύτη, πράγμα που δείχνει ότι μόρια RNA μπορεί να έχουν μεγάλη καταλυτική ισχύ. Αυτή η ανακάλυψη μας κάνει να υποθέσουμε ότι σε μία αρχική φάση της εξέλιξης το RNA μπορούσε να αναπαράγεται από μόνο του χωρίς τη συμμετοχή των πρωτεϊνών. [1]
Ένας άλλος µηχανισµός µε τον οποίο διαφορετικοί τύποι κυττάρων µπορούν να παράγουν διαφορετικές ποσότητες µιας πρωτεΐνης, ή ακόµα και διαφορετικές πρωτεΐνες, είναι η διαφορετική συναρµογή (μάτισμα-splicing) του pre mRNA. Τα διαφορετικά πρότυπα συναρµογής µπορεί να περιλαµβάνουν ακριβώς τα ίδια εξώνια. Στην περίπτωση αυτή η πρωτεΐνη είναι ακριβώς η ίδια, αλλά ο ρυθµός σύνθεσης µπορεί να διαφέρει, επειδή τα µόρια του mRNA δεν µεταφράζoνται µε την ίδια ένταση. Στην Eικόνα 13 φαίνεται πως η εναλλακτική συναρµογή οδηγεί σε διαφορετική αλληλουχία οδηγό (leader sequence) στα δύο mRNA. Σ’ άλλες πάλι περιπτώσεις το pre mRNA υπόκειται σε διαφορετική συναρµογή σε διαφορετικούς ιστούς, µε αποτέλεσµα τα ώριµα mRNA να κωδικοποιούν πρωτεΐνες που δεν είναι ίδιες, αν και θα έχουν κάποια εξώνια κοινά.[6]
Εικόνα 13 [6]
Σε διαφορετική συναρµογή οφείλεται ο καθορισµός του φύλου στην Drosophila melanogaster. Όπως φαίνεται στην Eικόνα 14 , στα αρσενικά άτοµα δεν υπάρχει το προϊόν του γονιδίου Sxl (Sex lethal), που υπάρχει όµως στα θηλυκά. Ο µετασχηµατισµός του εµβρύου προς τη θηλυκή κατεύθυνση εξαρτάται από το προϊόν του γονιδίου tra (transformer). Το γονίδιο tra έχει δύο θέσεις συναρµογής, την 1 µέσα στο εσώνιο και τη 2 στα όρια εσωνίου – εξωνίου. Όταν δεν υπάρχει η πρωτεΐνη Sxl, τότε η συναρµογή χρησιµοποιεί τη θέση 1, µε αποτέλεσµα να προκύπτει ένα mRNA,το οποίο, επειδή φέρει ένα κωδικό λήξης AUG, µεταφράζεται σ’ ένα πρωτεϊνικό προϊόν ελλειµµατικό και κατά συνέπεια µη λειτουργικό, µε αποτέλεσµα το έµβρυο να αναπτύσσεται σε αρσενικό. Όταν όµως υπάρχει το γονιδιακό προϊόν Sxl, τότε αυτό προσκολλάται στη θέση συναρµογής 1, µε αποτέλεσµα να µην αναγνωρίζεται από το συναρµόσωµα (spliceosome) και να χρησιµοποιείται η θέση 2. Το mRNA που προκύπτει στην περίπτωση αυτή µεταφράζεται σε κανονική πρωτεΐνη tra και το έµβρυο αναπτύσσεται ως θηλυκό. Η σύνθεση της πρωτεΐνης Sxl εξαρτάται από το λόγο των Χ χρωµατοσωµάτων προς τις αυτοσωµατικές σειρές (Α). Εάν ο λόγος Χ/Α ισούται µε 1, τότε παράγεται η κρίσιµη ποσότητα της Sxl πρωτεΐνης για την κατάληψη της θέσης συναρµογής 1, ενώ εάν X/A=1/2, δεν παράγεται.[6]
Εικόνα 14 [6]
Οι επιστήμονες του Πανεπιστημίου Duke υποστηρίζουν ότι η επίτευξη της διαδικασίας, που έγινε σε ποντικό, θα συμβάλλει στην κατανόηση ενός ζητήματος που είναι κλειδί στη βιολογία ανθρώπου, του πώς δηλαδή το ίδιο γονίδιο σε διαφορετικούς ιστούς μπορεί να κωδικοποιήσει την παραγωγή διαφορετικών πρωτεϊνών. Τα ευρήματα αυτά μπορούν επίσης να βοηθήσουν να ριφθεί φως σε ένα αριθμό ασθενειών, συμπεριλαμβανομένου και του καρκίνου στον οποίο η εναλλακτική ωρίμανση (alternative splicing) γίνεται λανθασμένα, ώστε να παράγονται και λανθασμένες πρωτεΐνες. Οι ερευνητές δημοσίευσαν τα αποτελέσματα της εργασίας τους στο περιοδικό RNA. Οι ερευνητές είχαν εξετάσει προηγουμένως την εναλλακτική ωρίμανση σε κύτταρα και ιστούς in vitro, αυτή όμως η μελέτη είναι η πρώτη in vivo παρατήρηση σε θηλαστικό λέει ο κύριος ερευνητής Mariano Garcia-Blanco, M.D., Ph.D., καθηγητής της μοριακής βιολογίας και της μικροβιολογίας. «Είμαστε σε θέση να παρατηρήσουμε την εναλλακτική ωρίμανση καθ' ον χρόνο συμβαίνει σε διαφορετικούς ιστούς. Αυτό είναι ένα εξαιρετικό παράδειγμα του πώς τα πειράματα σε ζωντανούς οργανισμούς παρέχουν πολύ πληρέστερη εικόνα για τη συμπεριφορά των γονιδίων σε σχέση με τα πειράματα που γίνονται σε κυτταρικές καλλιέργειες». Μέχρι πριν 20 χρόνια οι επιστήμονες πίστευαν ότι ένα γονίδιο κωδικοποιεί τη σύνθεση μιας πρωτεΐνης.
Εικόνα 15. Αναφορές της σίγασης του εξωνίου FGFR2 IIIb στα διαγενετικά ποντίκια. [7]
Με την ανακάλυψη της εναλλακτικής ωρίμανσης έγινε αντιληπτό ότι ένα γονίδιο μπορεί να κωδικοποιήσει την παραγωγή πολυάριθμων πρωτεϊνών. Στην εναλλακτική ωρίμανση με τον συνδυασμό διαφορετικών εξωνίων μπορεί να προκύψει διαφορετικό μόριο m RNA και συνεπώς διαφορετική πρωτεΐνη. Στη διεργασία αυτή παίρνουν μέρος πρωτεΐνες που χαρακτηρίζονται αποσιωπητές και ενισχυτές. Στην τρέχουσα μελέτη η ομάδα του Garcia-Blanco προσπάθησε να καθορίσει ποιοι αποσιωπητές αποκόπτουν ένα σημαντικό τμήμα του RNA σε ένα γονίδιο που ονομάζεται παράγοντας ανάπτυξης ινοβλάστης 2 (FGFR2). Το γονίδιο αυτό παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του ποντικού και του ανθρώπου και ο τρόπος με τον οποίο το ώριμο m RNA συναρμολογείται μπορεί να μεταβάλλει την ανάπτυξη του οργανισμού. Ως σύστημα μελέτης οι επιστήμονες δημιούργησαν έναν γενετικά τροποποιημένο "φωσφορίζοντα" ποντικό.
Εικόνα 16. Απεικόνιση της σίγασης του FGFR2 εξωνίου IIIb σε ολόκληρα τα ζώα. Άγριος-τύπος (WT), GIIIb/ Rint, και G
/Rint ποντίκια απεικονίστηκαν σε ένα κουτί μέτριου φθορισμού. Οι εικόνες αποκτήθηκαν για 300 msec με μια CCD κάμερα που χρησιμοποιούσε RFP η GFP διέγερσης / εκπομπής φίλτρα.[7]
Ο ποντικός αυτός έφερε στο γονίδιο FGFR2 έναν στόχο, που φωσφορίζει όποτε ένας κοινός τύπος αποσιωπητή (εσωνικός αποσιωπητής), αποκόπτει ένα συγκεκριμένο εξώνιο που χαρακτηρίζεται IIIb. (Εικόνα 15) Με αυτόν τον τρόπο οι επιστήμονες μπορούσαν να γνωρίζουν αν ο εσωνικός αποσιωπητής αποκόπτει το εξώνιο IIIb, και αν το κάνει, να προσδιορίσουν τα είδη των ιστών και των οργάνων στα οποία συμβαίνει η διαδικασία, όπως επίσης να διαπιστώσουν αν συμμετέχουν και άλλοι τύποι αποσιωπητών και βοηθητικών πρωτεϊνών.(Εικόνα 16) Με την εφαρμογή αυτής της μεθόδου η ομάδα βρήκε ότι αν και τα κύτταρα στους περισσότερους ιστούς αποσιωπούν το εξώνιο IIIb, χρησιμοποιούν μια ποικιλία αποσιωπητών και βοηθητικών πρωτεϊνών, για να το κατορθώσουν, όπως υποστηρίζει η Vivian I. Bonano, μεταπτυχιακή φοιτήτρια στο πρόγραμμα Γενετικής και Γενωμικής του Πανεπιστημίου και εκ των συγγραφέων του άρθρου. «Με τον καθορισμό των αποσιωπητών που είναι ενεργοί σε ένα δεδομένο ιστό ή όργανο, οι επιστήμονες θα βοηθηθούν να καταλάβουν πώς τα εξώνια συμπεριλαμβάνονται ή αποκλείονται εσφαλμένα από το ώριμο m RNA, σε διάφορα νοσήματα» υποστηρίζει η Bonano και εξηγεί ότι η απόφαση ενός κυττάρου να αποκλείσει στο εξώνιο IIIb είναι κρίσιμη, επειδή η παρουσία η απουσία του εξωνίου καθορίζει ποιός από τους εναλλακτικούς τύπους της πρωτεΐνης FGFR2 θα παραχθεί. Τέτοιες μεταβολές στις πρωτεΐνες μπορούν να μεταβάλλουν τη συμπεριφορά του κυττάρου. «Η παρατήρηση αυτής της διαδικασίας στον ζωντανό οργανισμό είναι πολύ σημαντική, καθώς τα κύτταρα συμπεριφέρονται διαφορετικά στο φυσικό περιβάλλον τους, παρά στο τεχνητά δημιουργημένο περιβάλλον των εργαστηριακών ιστοκαλλιεργειών», λέει ο Garcia-Blanco και προσθέτει: «Η πολυπλοκότητα της εναλλακτικής ωρίμανσης επιβάλλει την ζωντανή απεικόνισή της, καθώς η απόσπαση ενός κυττάρου από το φυσικό του πλαίσιο δείχνει μόνο την τρέχουσα κατάστασή του και όχι το πως έφθασε σε αυτήν. Για παράδειγμα η διαδικασία της ωρίμανσης μπορεί να αλλάζει από μέρα σε μέρα, καθώς το ζώο αναπτύσσεται με αποτέλεσμα η εξαγωγή των κυττάρων και η παρατήρησή τους σε κυτταροκαλλιέργειες να μην αποκαλύπτει όλα τα μεταβατικά στάδια των αλλαγών». Επίσης, διαφορετικοί τύποι κυττάρων του εγκεφάλου και άλλων οργάνων μπορούν να παρουσιάζουν διαφορετικές αποφάσεις ωρίμανσης. Για παράδειγμα οι νευρώνες που βρίσκονται κοντά στα νευρογλοιακά κύτταρα του εγκεφάλου, κωδικοποιούν την παραγωγή διαφορετικών πρωτεϊνών σε διαφορετικά ποσά, και η παρατήρηση αυτών των διαφορών είναι πολύ δύσκολο να πραγματοποιηθεί σε κυτταροκαλλιέργειες. «Η μέθοδος αυτή εφαρμοζόμενη στη γενετική του ποντικού, είναι ένα ισχυρό όπλο για την κατανόηση του πότε και του πώς λαμβάνονται οι αποφάσεις για την ωρίμανση και επίσης για τον προσδιορισμό των παραγόντων που είναι κρίσιμοι γι’αυτήν», λέει ο Garcia-Blanco και προσθέτει: «Με δεδομένο τη σημασία της εναλλακτικής ωρίμανσης για την υγεία και την νόσο, η ανατομική χαρτογράφηση των αποφάσεων για την ωρίμανση θα μας βοηθήσει να κατανοήσουμε πώς πολλές ασθένειες του ανθρώπου σχετίζονται με λανθασμένη ρύθμιση της ωρίμανσης».[7]
Το Pre-mRNA μάτισμα είναι μια περίπλοκη και πανταχού παρούσα πυρηνική διαδικασία, όποια είναι μια φυσική πηγή καρκίνου - πρόκλησης των λαθών κατά την έκφραση των γονιδίων. Μεταλλαγές περιοχών συναρμογών εσωνίων από τα ογκοκατασταλτικά γονίδια είναι συχνά η αιτία του γεγονότος που πηδά ένα εξωνίο και περικόπτεται μια πρωτεϊνη ακριβώς όπως στις κλασσικές ανερμηνεύσιμες μεταλλαγές. Επίσης, πολλές μελέτες κατά τη διάρκεια των τελευταίων 20 ετών δημοσιευτεί σχετικά με καρκίνο που σχετίζεται με το εναλλακτικό μάτισμα λόγω της έλλειψης γενωματικών μεταλλαγών. Επηρεασθείς πρωτεϊνες περιλαμβάνουν παράγοντες της μεταγραφής, μετατροπείς σημάτων κυττάρων, και συστατικά της εξωκυτταρικής μήτρας. Αντισώματα πάλι, εναλλακτικά ματισμένα προϊόντα, είναι αυτήν την περίοδο στις κλινικές δοκιμές σε καρκινικά κύτταρα, και ανταγωνιστικά PCR αντίστροφης μεταγραφής, στις περιοχές του εναλλακτικού ματίσματος, χρησιμοποιείται σε απλά διαγνωστικά τέστ. Όπως και την ένωση με τον καρκίνο, the φύση των εναλλακτικών προϊόντων των γονιδίων είναι συνήθως σύμφωνος με έναν ενεργό ρόλος στον καρκίνο; επομένως, η ίδια η διαδικασία του εναλλακτικού ματίσματος είναι ένας πιθανός στόχος για τη θεραπεία γονιδίων.[8]
Ü Στοιχεία εκπαιδευτικού:
Ονοματεπώνυμο: Μπακολίτσας Κωνσταντίνος
Βαθμίδα εκπαίδευσης: Δευτεροβάθμια Εκπαίδευση
Ειδικότητα: Βιολόγος ΠΕ04(04)
Μαθήματα που διδάσκει : Βιολογία.-Φυσική-Χημεία.
Τίτλος μαθήματος: «Tα κυριότερα στάδια της ωρίμανσης του mRNA και ο φυσικός τους ρόλος»
Ü Γνωστικό αντικείμενο (Σχέση με το Πρόγραμμα Σπουδών): Βιολογία Γενικής Παιδείας, και Βιολογία Κατεύθυνσης.
Ü Τάξη: Β' Λυκείου, Γ΄ Λυκείου (αντίστοιχα)
Ü Διδακτική ενότητα: 4ο Κεφάλαιο, 2ο Κεφάλαιο (αντίστοιχα)
Ü Προβλεπόμενος χρόνος: 2 διδακτικές ώρες. Αυξομειώσεις κατά το δοκούν.
Σκοποί διδασκαλίας
Ο μαθητής θα πρέπει να :
ü Αναγνωρίζει ότι οι επιστημονικές ερμηνείες για τα φαινόμενα της ζωής θα πρέπει να πληρούν συγκεκριμένα κριτήρια, για να γίνονται αποδεκτές, και να κατανοεί τη συμβολή των θεωριών στην πρόοδο της επιστήμης.
ü Να περιγράφει το κεντρικό δόγμα της Βιολογίας και να γνωρίζει τη θέση που κατέχει η ωρίμανση σ’ αυτό το δόγμα.[8]
ü Να περιγράφει τα στάδια της ωρίμανσης του mRNA, να γνωρίζει τη σειρά με την οποία αυτά γίνονται και το γιατί ακολουθείται αυτή η σειρά.
ü Να εξηγεί τον φυσικό ρόλο του κάθε σταδίου, τον ρόλο του capping,
1. να περάσει από τους πόρους της πυρηνικής μεμβράνης κατά τη μετάβαση του στο κυτταρόπλασμα, όπου και κάνει τη δουλειά του.
2. να δεσμευτεί στο ριβόσωμα, και
3. να προστατευθεί από υδρολυτική αποικοδόμηση από το 5' άκρο.
τον ρόλο της poly A ουράς που απαιτείται για την εξαγωγή του mRNA μέσω των πυρηνικών πόρων αποτρέπει υποβάθμισή του στο κυτταρόπλασμα και συμβάλλει στη σταθεροποίηση του μορίου
ü Να γνωρίζει για τις καταλυτικές ιδιότητες του rRNA της μεγάλης ριβοσωμικής υπομονάδας και του snRNA, και για τον καταλυτικό μηχανισμό του αυτοματιζόμενου εσωνίου στη Tetrahymena.
ü Να γνωρίζει τον µηχανισµό µε τον οποίο διαφορετικοί τύποι κυττάρων µπορούν να παράγουν διαφορετικές ποσότητες µιας πρωτεΐνης, ή ακόµα και διαφορετικές πρωτεΐνες, που γίνεται με διαφορετική συναρµογή (μάτισμα-splicing) του pre mRNA και ότι σε διαφορετική συναρµογή οφείλεται και ο καθορισµός του φύλου στην Drosophila melanogaster.
ü Χρησιμοποιεί γνώσεις και δεξιότητες που απέκτησε για την επεξεργασία και την αξιολόγηση δεδομένων ή την επίλυση προβλημάτων.
ü Συλλέγει πληροφορίες από επιστημονικές πηγές πληροφοριών ή πλήρεις μελέτες τεκμηρίωσης και να χρησιμοποιεί την τεχνολογία της Πληροφορικής, όπου αυτή μπορεί να εξυπηρετήσει τις ανάγκες της εργασίας του.
ü Μελετά μόνος ή σε συνεργασία με τους συμμαθητές, τον εκπαιδευτικό αλλά και άλλους φορείς του τοπικού κοινωνικού περιβάλλοντος, θέματα που αφορούν το σχολικό ή το ευρύτερο κοινωνικό περιβάλλον.
ü Αξιολογεί τη δράση του στις διάφορες εκπαιδευτικές δραστηριότητες, συνεκτιμώντας τους παράγοντες επιτυχίας και αποτυχίας. [9]
Διδακτικοί στόχοι
· Γνωστικοί
· Ψυχοκινητικοί
· Συναισθηματικοί
Ειδικοί στόχοι :
1) Οι μαθητές ασκούνται στην έρευνα και την αξιολόγηση των πηγών του διαδικτύου (internet).
2) Ασκούνται στην επιλογή πληροφοριών από το διαδίκτυο.
3) Εξοικειώνονται με τις μηχανές αναζήτησης. Μαθαίνουν να αναζητούν ένα βιβλίο σε μια ηλεκτρονική βιβλιοθήκη, ένα ηλεκτρονικό βιβλίο σε ένα ηλεκτρονικό βιβλιοπωλείο, και μαθαίνουν να θέτουν κριτήρια κατά την αναζήτηση.
4) Εξοικειώνονται με τη χρήση του επεξεργαστή κειμένου, του λογισμικού παρουσιάσεων κλπ.
Παιδαγωγικοί στόχοι
Παιδαγωγικές αρχές και μέθοδοι: Η διδασκαλία στηρίζεται στην ενθάρρυνση από τον εκπαιδευτικό της ενεργητικής συμμετοχής και της εμπλοκής των μαθητών στη μαθησιακή διαδικασία (συμμετοχή σε συζήτηση, σε συνεργατικές πρακτικές δραστηριότητες).
Μεθοδολογικές προσεγγίσεις της διδασκαλίας
Χρήση τεχνικών που ενισχύουν την ενεργητική συμμετοχή.
Εισήγηση μικρής διάρκειας που έχει φωτοτυπηθεί και έχει διανεμηθεί σε όλους τους μαθητές. Για παράδειγμα μπορούμε να ξεκινήσουμε την εισήγηση με αναφορά στο ότι μερικοί τύποι θαλασσαιμίας (μίας ομάδας κληρονομικών ασθενειών του αίματος που διακρίνονται από τη μη φυσιολογική σύνθεση αιμοσφαιρίνης) προκαλούνται από έκτροπη ωρίμανση του mRNA της αιμοσφαιρίνης π.χ. μετάλλαξη μίας G σε Α, 19 νουκλεοτίδια μακριά από την κανονική θέση διάσπασης του πρώτου εσωνίου δημιουργεί μία νέα θέση διάσπασης. Να πούμε δύο λόγια για την ασθένεια και την συχνότητα εμφάνισής της στη χώρα μας και ότι θα διαπραγματευτούμε τη χημική της βάση.
· Εύστοχες ερωτήσεις που βοηθούν να διευκρινιστούν οι κύριες έννοιες που εστιάζουν τη σκέψη των μαθητών. Έλεγχος για προηγούμενες γνώσεις, εμπειρίες και βιώματα των μαθητών και με χρήση ερωτηματολογίου που τους δίδεται πριν την έναρξη του μαθήματος .
· Συζήτηση - διάλογος με τους μαθητές σχετικά με τις απαντήσεις που έδωσαν. Κλίμα αμοιβαίας επικοινωνίας φιλικό ευχάριστο και ευγενικό.
· Καταιγισμός ιδεών π.χ. στην έννοια ωρίμανση.
· Επίδειξη - παρουσίαση διαφανειών που θα έχουν σχεδιαστεί με τους μηχανισμούς της ωρίμανσης βήμα προς βήμα ή προβολή βίντεο που θα έχει επιλεγεί για το μάθημα αυτό.
· Ενδιάμεσες ανακεφαλαιώσεις για να επισημάνουμε τα πλέον ουσιώδη σημεία από όσα θα θίξουμε, για να ελέγξουν οι μαθητές αν αυτά που κατάλαβαν είναι και τα σωστά, για να διορθώσουν τυχόν δικές τους παρερμηνείες ή παρανοήσεις, για να προχωρήσουν με σιγουριά στο επόμενο βήμα, εφοδιασμένοι με ορθές και επιβεβαιωμένες γνώσεις.[10]
· Ομάδες εργασίας:
o Συγκρότηση ομάδων (προτείνεται οι μαθητές να χωριστούν σε ομάδες με βάση τη δική τους προτίμηση. Ο καθηγητής φροντίζει με διακριτικότητα να υπάρχει σε κάθε ομάδα ένας μαθητής που χειρίζεται με άνεση τον υπολογιστή) και επιλογή ενός θέματος από κάθε ομάδα π.χ. η το εναλλακτικό μάτισμα και το αποτέλεσμα που έχει.
o Καθορισμός στόχων και επιμερισμός εργασίας στα μέλη της κάθε ομάδας.
o Καθορισμός πηγών πληροφόρησης (θα δοθεί λίστα διευθύνσεων στο internet , μηχανών αναζήτησης κ.λ.π. ) και συλλογή στοιχείων.
o Θα γίνεται επιμέρους αξιολόγηση της πορείας της εργασίας (και αν υπάρξει ανάγκη , θα γίνει επαναπροσδιορισμός των στόχων)
o Ταξινόμηση, αξιολόγηση και σύνθεση δεδομένων.
o Παρουσίαση της εργασίας από έναν μαθητή κάθε ομάδας και τελική αξιολόγηση στην τάξη. [11]
o Προσομοίωση με χρήση λογισμικού όπως το αλληλεπιδραστικό εκπαιδευτικό λογισμικό ‘Life 5.0, το Interactive Study Partner, και το BIOL 139/GENETICS.
Ρόλοι και ενέργειες του καθηγητή.
Ο καθηγητής έχει το ρόλο του διευκολυντή της υλοποίησης του σχεδίου. Παρακολουθεί διακριτικά τις εργασίες των ομάδων και συζητά με τις ομάδες των μαθητών, χωρίς να προκαταλαμβάνει ή να κατευθύνει άμεσα τις ενέργειές τους.
Μέσα και υλικό
Εξοπλισμός: Υπολογιστές με σύνδεση στο Διαδίκτυο, βιντεοπροβολέας, οθόνη προβολής, πακέτα κατασκευής χημικών μοντέλων, κλπ.
Λογισμικό:
Office 2003, Windows XP, Wbs, αλληλεπιδραστικό εκπαιδευτικό λογισμικό:
· BIOL 139/GENETICS.[12]
· Interactive Study Partner.[13]
· ‘Life 5.0 .[14],
Αξιολόγηση
Μπορεί να είναι συντρέχουσα και τελική. Συντρέχουσα θα γίνεται κατά τη διάρκεια του μαθήματος με τον καθηγητή να παρατηρεί πως εργάζονται οι ομάδες.Στό τέλος θα εξακριβώσει με γραπτό ή προφορικό τρόπο πόσο καλά οικοδομήθηκε η νέα γνώση. Αρχικά η αξιολόγηση των μαθητών μπορεί να γίνει με τη μέθοδο της παρατήρησης.
Καταρχάς απαιτείται προγραμματισμός, στη συνέχεια διενέργεια της παρατήρησης, επεξεργασία των αποτελεσμάτων και τέλος παρεμβάσεις.
Στη διάρκεια του μαθήματος ο καθηγητής θα πρέπει να παρακολουθεί τους μαθητές και να καταγράφει (με μορφή βαθμολόγησης) τις παρατηρήσεις του σε κατάλληλο φύλλο. Μπορεί επίσης να ετοιμάσει ένα σύντομο τέστ, που μπορεί να είναι αποθηκευμένο στη σελίδα του καθηγητή στο ίντερνετ ή στο e-class του σχολικού δικτύου. Οι μαθητές μπορούν να απαντούν γραπτά το τέστ και έτσι ο καθηγητής θα είναι σε θέση να κάνει τη βαθμολόγηση στο σπίτι και να τα επιστρέψει διορθωμένα στο επόμενο μάθημα.[15]
Έτσι μπορεί να ελέγξει αν αποκτήθηκαν οι γνώσεις, αν μορφώθηκαν στάσεις και συμπεριφορές, αν γενικά πέτυχε τους στόχους που είχε αρχικά θέσει και σε ποιο ποσοστό. Αν δεν τους πέτυχε, να ελέγξει τι έφταιξε.
ΦΥΛΛΟ ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΕΩΝ | ||
ΤΜΗΜΑ: ΣΤΑΔΙΟ ΕΡΓΑΣΙΑΣ: | ||
ΕΝΕΡΓΕΙΕΣ | ΜΑΘΗΤΗΣ 1 | ΜΑΘΗΤΗΣ 2 |
Πληρότητα της παρουσίασης της εργασίας |
|
|
Ποιότητα των ερωτήσεων |
|
|
Σαφήνεια των απαντήσεων |
|
|
Ενδεχόμενα προβλήματα και πιθανές λύσεις.
Επειδή το παρόν σχέδιο μαθήματος στηρίζεται και στην περιήγηση σε συγκεκριμένους ιστοχώρους , ενδέχεται να εμφανιστούν προβλήματα που οφείλονται στη μη λειτουργία κάποιου ιστοχώρου ή και γενικότερα του Διαδικτύου τη δεδομένη χρονική στιγμή, ο καθηγητής θα πρέπει να έχει ¨κατεβάσει¨ τις ιστοσελίδες με το webstripper, λογισμικό που κάνει αυτή τη δουλειά και διατίθεται ελεύθερα , να τις αποθηκεύσει στον κεντρικό υπολογιστή του εργαστηρίου και έτσι να γίνεται η περιήγηση χωρίς σύνδεση.
Εργασίες για το σπίτι
Οι εργασίες που θα μπορούσαν να δοθούν σε ομάδες μαθητών είναι:
- Διαφορές στη διαδικασία της ωρίμανσης του mRNA μεταξύ προκαρυωτικών και ευκαρυωτικών κυττάρων.
- Συνέπειες του εναλλακτικού ματίσματος.
- Προβλήματα υγείας από λάθη στη διαδικασία της ωρίμανσης του mRNA.
[1] http://www-jcb.bio.auth.gr/mor_biol/nucleicacids/frames/na31.htm
[2] ΓIANNOΠOYΛOΣ Γ, Γενετική Τόμος Α, Πρόγραµµα Σπουδών ΣΠOY∆EΣ ΣTIΣ ΦYΣIKEΣ EΠIΣTHMEΣ, Ε.Α.Π.,Πάτρα 2001, σελ.195.
[3] Γιωργάτσος Γ., Μοριακή βιολογία, Δομή και λειτουργία του κυττάρου, Τόμος Γ, Ε.Α.Π. Πάτρα 2001, σελ.89-94.
[4] www.steve.gb.com/science/transcription.html
[5] Berg J., Tymoczko J., Stryer L., Βιοχημεία, Τόμος ΙΙ, Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, Ηράκλειο 2005, σελ. 901-906
[6] ΓIANNOΠOYΛOΣ Γ, Γενετική Τόμος Α, Πρόγραµµα Σπουδών ΣΠOY∆EΣ ΣTIΣ ΦYΣIKEΣ EΠIΣTHMEΣ, Ε.Α.Π.,Πάτρα 2001, σελ.284-285.
[7] Vivian
[8] Julian P. Venables, Aberrant and Alternative Splicing in Cancer, [Cancer Research 64, 7647-7654, November 1, 2004] © 2004 American Association for Cancer Research
[9] Βιβλίο Καθηγητή, Βιολογία Θετικής κατεύθυνσης Γ΄τάξης Ενιαίου Λυκείου, Ο.Ε.Δ.Β.2004,σελ.23.
[10] Καψάλης Α., κ.α., Βιολογία γενικής παιδείας Β’ τάξης ενιαίου λυκείου, Βιβλίο καθηγητή ΟΕΔΒ , σελ 14-15.
[11] Αργύρης Ι., Ειδική Διδακτική της Βιολογίας, 2η έκδοση, Θεσσαλονίκη 2002, σελ.83.
[12] Post Transcriptional processing in Eukaryotes, BIOL 139 /GENETICS /COURSE /MODULES /MODULES6/6D3.HTML
[13] Cambell, Reece, Mitchell, Interactive Study Partner to accompany Biology, Fifth Edition, Chapter 17 ,From the Gene to protein, Activity 17.3 RNA Processing.
[14] The mona Group LLC, LIFE: The science of biology, 5th ed., 14. The Eukaryotic Genome and its Expression, 1998, http://www.monagroup.com
[15] http://eclass.sch.gr/courses/EL184101
àΤο λογισμικό των παραπομπών [12],[13],[14], αποστέλλεται συννημένα με την εργασία
17. Δομή, κατηγορίες και λειτουργία του ριβoσωμικού RNA.
O πυρηνίσκος είναι υπεύθυνος για την παραγωγή και την ωρίµανση του rRNA, καθώς και την αυτοσυγκρότηση των ριβοσωµατικών υποµονάδων Στον πυρηνίσκο παράγονται τα περισσότερα συστατικά των ριβοσωµάτων και γίνεται η ωρίµανση τωνrRNA, σε 18S, 5,8S και 28S rRNA. Nα σηµειωθεί ότι το 5S rRNA συνθέτεται έξω από τον πυρηνίσκο και κατόπιν µεταφέρεται σε αυτόν. Tο ίδιο συµβαίνει και µε τις ριβοσωµατικές πρωτεΐνες. Παράγονται στο κυτταρόπλασµα και κατόπιν µεταφέρονται στονπυρηνίσκο. Στον πυρηνίσκο, τέλος, συνθέτονται ή µεταφέρονται αρκετές ακόµη πρωτεΐνες και RNA, που συµµετέχουν µόνο στη ρύθµιση της σύνθεσης των συστατικών των ριβοσωµάτων ή στην αυτο-συγκρότησή τους. (Εικόνα 1,2)[1]
Επίσης στα σπονδυλωτά ο βαρύς κλώνος του μιτοχονδριακού DNA κωδικεύει και για δύο rRNA.[2]
Τα χλωροπλαστιακά DNA είναι κυκλικά μόρια 120.000-160.000 bp ανάλογα με τα είδη. Από περίπου 120 γονίδια στο DNA των χλωροπλαστών, τα 60 αφορούν στη μεταγραφή και τη μετάφραση RNA. συμπεριλαμβανομένων των γονιδίων για rRNAs, tRNAs, υπομονάδων της RNA πολυμεράσης, και τις ριβοσωμικές πρωτεϊνες. [3]
`
Εικόνα 1 Ηλεκτρομικρογραφία μονάδων μεταγραφής του pre-rRNA από πυρήνες ωοκυττάρων βάτραχου.[4]
Εικόνα 2 ∆ιαγραµµατική απεικόνιση της λειτουργικότητας του πυρηνίσκου[1]
Τα μόρια των rRNA σε αντίθεση με τα μόρια tRNA και mRNA ,που λειτουργούν γυμνά βρίσκονται μέσα στα ριβοσώματα όπου και λειτουργούν , σαν σύμπλοκα με τις ριβοσωμικές πρωτεϊνες. Δεν γνωρίζουμε ακόμα την τρισδιάστατη διαμόρφωσή τους, αλλά η πρωτοταγής τους δομή, που είναι γνωστή, μας λέει ότι πρέπει να υπάρχουν ενδομοριακές αναδιπλώσεις.(Εικόνα 2)[5]
Τα ριβοσωμικά rRNA αναδιπλώνονται σε καθορισμένες δομές με πολλές μικρές δίκλωνες περιοχές. Το συμπέρασμα αυτό και ουσιαστικά όλα τα χαρακτηριστικά της δευτεροταγούς δομής έχουν επιβεβαιωθεί από τις δομές που προσδιορίστηκαν κρυσταλλογραφικά με ακτίνες Χ.[6]
Tο ριβόσωμα είναι ένα πολύπλοκο οργανίδιο, που σχηματίζεται από ριβοσωμικό RNA (rRNA) και ειδικές ριβοσωμικές πρωτεΐνες. Το ριβόσωμα δεν περιβάλλεται από μεμβράνη. Το rRNA αποτελεί το 55%, σε βάρος, του ριβοσώματος. Κάθε ριβόσωμα αποτελείται από δύο υπομονάδες με ανόμοιο μέγεθος, τη μικρή και τη μεγάλη ριβοσωμική υπομονάδα. Κάθε υπομονάδα αποτελείται από ειδικά ριβοσωμικά RNA και ιδιαίτερες ριβοσωμικές πρωτεΐνες. Στα ευκαρυωτικά κύτταρα τα ριβοσώματα έχουν σταθερά καθίζησης 80S και οι υπομονάδες τους έχουν σταθερές καθίζησης 60S και 40S. Τα ριβοσώματα των προκαρυωτικών οργανισμών είναι μικρότερα (70S) και αποτελούνται από δύο υπομονάδες, 50S και 30S.(Εικόνα 3 ) Τα ριβοσώματα που υπάρχουν στα μιτοχόνδρια και τους χλωροπλάστες, είναι συνήθως μικρότερα τόσο από τα ευκαρυωτικά όσο και από τα προκαρυωτικά ριβοσώματα. Το ΜΒ του ευκαρυωτικού ριβοσώματος είναι περίπου 4.500 kD, ενώ του προκαρυωτικού ριβοσώματος φτάνει τα 2.500 kD.
Στην Escherichia coli, η μικρή ριβοσωμική υπομονάδα 30S αποτελείται από ένα μόριο 16S rRNA και 21 διαφορετικές ριβοσωμικές πρωτεΐνες. Η μεγάλη ριβοσωμική υπομονάδα 50S, αποτελείται από δύο μόρια rRNA, το 23S rRNA και το 5S rRNA καθώς επίσης και από 34 περίπου ριβοσωμικές πρωτεΐνες. Στα ευκαρυωτικά κύτταρα, η μικρή ριβοσωμική υπομονάδα αποτελείται από ένα μόριο 18S rRNA και 30 περίπου ριβοσωμικές πρωτεΐνες, ενώ η μεγάλη ριβοσωμική υπομονάδα αποτελείται από τρία μόρια rRNA, τα 28S rRNA, 5S rRNA και 5,8S rRNA, και 40 περίπου ριβοσωμικές πρωτεΐνες. Kατά τα διάφορα στάδια της μετάφρασης του mRNA διάφοροι πρωτεϊνικοί παράγοντες που συμμετέχουν σ’ αυτή τη διαδικασία συνδέονται παροδικά με το ριβόσωμα.[7]
Εικόνα 3 [7]
Το rRNA αναδιπλώνεται και δίνει μια δευτεροταγή δομή η οποία αποτελεί και τη βασική οργάνωση της ριβοσωμικής υπομονάδας. Η αναδίπλωση αυτή δημιουργεί ένα τρισδιάστατο πλέγμα μέσα στο οποίο τοποθετείται επακριβώς κάθε ριβοσωμική πρωτεΐνη. Όπως έχει αποδειχτεί με τη χρήση ηλεκτρονικής μικροσκοπίας, η μικρή ριβοσωμική υπομονάδα της Escherichia coli έχει διαστάσεις 22 x 14 x 11 nm, ενώ της μεγάλης έχει διαστάσεις 23 x 23 x 15 nm. Κάθε υπομονάδα έχει μια χαρακτηριστική και αναγνωρίσιμη μορφολογία. Η μικρή υπομονάδα αποτελείται από μια “κεφαλή”, ένα “σώμα” και μια “πλατφόρμα”, ενώ η μεγάλη ριβοσωμική υπομονάδα έχει τρία εξογκώματα στην “ανώτερη” περιοχή, με πιο χαρακτηριστικό το κεντρικό εξόγκωμα.
Η μικρή ριβοσωμική υπομονάδα παρουσιάζει σχήμα εμβρύου, ενώ η μεγάλη ριβοσωμική υπομονάδα μοιάζει με πολυθρόνα η οποία έχει τρεις βραχίονες. Μια ελαφρά κλίση της μικρής υπομονάδος δημιουργεί στη μια άκρη της μια πεπλατυσμένη περιοχή που ονομάζεται “πλατφόρμα”. Η περιοχή αυτή ταιριάζει επακριβώς σε μια εγκοπή της μεγάλης ριβοσωμικής υπομονάδος, όταν οι δύο υπομονάδες ενώνονται για το σχηματισμό λειτουργικού ριβοσώματος. Η θέση αποκωδικοποίησης, δηλ. η περιοχή αναγνώρισης των κωδικονίων του mRNA από τα αντικωδικόνια tRNA, βρίσκεται στη μικρή ριβοσωμική υπομονάδα στη βάση της ρωγμής που χωρίζει την “κεφαλή” από την “πλατφόρμα”. Στη μεγάλη ριβοσωμική υπομονάδα έχει βρεθεί ένα κανάλι με μήκος 10 nm και διάμετρο 2,5 nm το οποίο διασχίζει τη μεγάλη ριβοσωμική υπομονάδα. Το κανάλι εκτείνεται από την περιοχή στην οποία βρίσκονται οι θέσεις Α και Ρ, μέχρι το σημείο εξόδου της νεοσχηματιζόμενης πολυπεπτιδικής αλυσίδας. Το κανάλι αυτό αποτελεί πιθανότατα το δρόμο που ακολουθεί η πολυπεπτιδική αλυσίδα αμέσως μετά τη έναρξη του σχηματισμού της μέχρι και τη στιγμή που εξέρχεται από το ριβόσωμα. Οι μικρές υπομονάδες των ευκαρυωτικών ριβοσωμάτων έχουν ορισμένα επιπλέον γνωρίσματα. Ένα απ’ αυτά είναι το “ράμφος” που επεκτείνεται στην αντίθετη κατεύθυνση από εκεί που βρίσκεται το ρήγμα. Το “ράμφος”, αν και μικρότερο, βρίσκεται επίσης και στη μικρή ριβοσωμική υπομονάδα των αρχαιοβακτηρίων. Ένα άλλο χαρακτηριστικό γνώρισμα της μικρής υπομονάδας των ευκαρυωτικών ριβοσωμάτων είναι δύο μικροί λοβοί που βρίσκονται στο άκρο της υπομονάδος, απέναντι από το κεφάλι. Πιστεύεται ότι οι λοβοί περιέχουν τις επιπλέον αλληλουχίες του 18S rRNA, που το διαφοροποιούν από το 16S rRNA των προκαρυωτικών ριβοσωμάτων.
Η ανάλυση της δομής του ριβοσώματος από την Escherichia coli με τη μέθοδο της κρυο-ηλεκτρονικής μικροσκοπίας, σε επίπεδο ανάλυσης 4 nm, έδειξε ότι το χάσμα μεταξύ των δύο ριβοσωμικών υπομονάδων προσφέρει άφθονο χώρο για τη σύνδεση των δύο μορίων tRNA και των άλλων μεταφραστικών συστατικών που απαιτούνται για την πρωτεϊνική σύνθεση. Επίσης, με την πειραματική αυτή προσέγγιση, έγινε δυνατή η παρατήρηση μιας “γέφυρας” που συνδέει τα 16S και 23S rRNA στην περιοχή της “πλατφόρμας” της υπομονάδας 30S.
Για τη διατήρηση της δομικής ακεραιότητας του ριβοσώματος απαιτούνται ιόντα Mg2+. Απλή ρύθμιση της συγκέντρωσης του Mg2+ είναι δυνατόν να προκαλέσει αποχωρισμό της μικρής από τη μεγάλη ριβοσωμική υπομονάδα. Οι υπομονάδες των ευκαρυωτικών ριβοσωμάτων αποχωρίζονται πιο δύσκολα και απαιτούνται συνήθως, εκτός από το Mg2+, χημικοί παράγοντες και αύξηση της θερμοκρασίας. Όταν η συγκέντρωση του Mg2+ πέσει κάτω από ένα συγκεκριμένο όριο, οι δύο ριβοσωμικές υπομονάδες αποχωρίζονται. Η διεργασία αυτή είναι αντιστρεπτή. Η απαιτούμενη συγκέντρωση του Mg2+ είναι 0,002Μ και πιστεύεται ότι η σύνδεση του Mg2+ στο ριβόσωμα γίνεται μέσω των φωσφορικών ριζών του rRNA.[8]
Αν και τα ριβοσώματα των ευκαρυωτικών οργανισμών δεν διαφέρουν λειτουργικά από τα ριβοσώματα των προκαρυωτικών, εντούτοις είναι πολύ μεγαλύτερα και οι περισσότερες πρωτεΐνες τους είναι διαφορετικές. Επίσης, πολλές από τις θέσεις αναγνώρισης και τους βοηθητικούς παράγοντες είναι διαφορετικοί. Η δράση διάφορων παρεμποδιστών είναι επίσης διάφορη. Η χλωραμφαινικόλη π.χ. επιδρά πάνω στα ριβοσώματα των βακτηρίων, ενώ το κυκλοεξαμίδιο δρα πάνω στην πρωτεϊνική σύνθεση των ευκαρυωτικών κυττάρων. Αυτό είναι ένα μεγάλο ευτύχημα για τους ανθρώπους αφού τα περισσότερα αντιβιoτικά παρεμποδίζουν την πρωτεϊνική σύνθεση. Λόγω των διαφορών μεταξύ του βακτηριακού συστήματος πρωτεϊνικής σύνθεσης και του αντίστοιχου ανθρώπινου, τα φάρμακα δρουν επιλεκτικά στα βακτήρια χωρίς να επηρεάζουν τον ανθρώπινο οργανισμό. Τα ριβοσώματα των μιτοχονδρίων και των χλωροπλαστών μοιάζουν με τα ριβοσώματα των βακτηρίων. Ριβοσώματα-υβρίδια που αποτελούνται από υπομονάδες βακτηρίων και χλωροπλαστών κάνουν πρωτεϊνική σύνθεση ενώ, το ίδιο φαινόμενο παρατηρείται σε ριβοσώματα-υβρίδια που αποτελούνται από υπομονάδες ριβοσωμάτων φυτών και θηλαστικών. Όμως, τα υβρίδια που αποτελούνται από υπομονάδες προκαρυωτικών και ευκαρυωτικών ριβοσωμάτων είναι ανενεργά.
Αν και πολλές ριβοσωμικές πρωτεΐνες έχουν αλλάξει πολύ κατά τη διάρκεια της εξελικτικής πορείας, η λειτουργία του ριβοσώματος έχει παραμείνει αναλλοίωτη. Το φαινόμενο αυτό δημιουργεί δύο βασικά ερωτήματα:
α. Πως είναι δυνατόν ένα τόσο σύνθετο οργανίδιο, τα δομικά στοιχεία του οποίου έχουν υποστεί τόσες αλλαγές, να διατηρεί ουσιαστικά αναλλοίωτη τη βασική λειτουργική του δράση, τόσο στα προκαρυωτικά όσο και στα ευκαρυωτικά κύτταρα; Η πιθανή απάντηση είναι ότι οι αλλαγές που έγιναν στην πρωτοταγή δομή των ριβοσωμικών πρωτεϊνών και των rRNA δεν επηρέασαν τη σωστή δομή και λειτουργία του ριβοσώματος. Οι αλλαγές αυτές δεν πρέπει επίσης να προκάλεσαν αλλαγή στην τοπογραφική κατανομή των ριβοσωμικών συστατικών.
β. Ποια εξελικτική πίεση οδήγησε στην αύξηση της πολυπλοκότητας του ευκαρυωτικού ριβοσώματος; Πιθανόν, λόγω της πολυπλοκότητας των ευκαρυωτικών κυττάρων, το ευκαρυωτικά ριβοσώματα απέκτησαν πιο πολύπλοκη δομή διότι πρέπει να επιτελέσουν περισσότερους ρόλους, στους οποίους περιλαμβάνονται και ο έλεγχος της πιστότητας της μετάφρασης του mRNA και της ρύθμισης της πρωτεϊνικής σύνθεσης. [9]
Περιληπτικά, η πορεία δημιουργίας των ριβοσωμικών υπομονάδων είναι η εξής: Το μεγάλο πρόδρομο rRNA μεταγράφεται μέσα στον πυρηνίσκο. Καθώς μεταγράφεται συνδέεται με ριβοσωμικές πρωτεΐνες που εισέρχονται στον πυρήνα μετά τη σύνθεσή τους στο κυτταρόπλασμα. Το μεγάλο πρόδρομο rRNA σπάζει αρχικά σε δύο τμήματα: το 18S rRNA και ένα μεγάλο κομμάτι που περιέχει τα 28S και 5,8S rRNA. Το τμήμα 18S rRNA, μαζί με τις συνδεδεμένες σ’ αυτό πρωτεΐνες της μικρής ριβοσωμικής υπομονάδος, απελευθερώνεται από τον πυρηνίσκο και εξέρχεται στο κυτταρόπλασμα. Το άλλο τμήμα που έχει απομείνει από το μεγάλο πρόδρομο rRNA, σπάζει και απελευθερώνονται τα 5,8S και 28SrRNA τα οποία συνδέονται με πρωτεΐνες της μεγάλης ριβοσωμικής υπομονάδος. Το 5S rRNA, μετά τη σύνθεσή του εκτός του πυρηνίσκου, εισέρχεται στην περιοχή του πυρηνίσκου και συνδέεται με τις αναπτυσσόμενες μεγάλες ριβοσωμικές υπομονάδες. Μετά την ολοκλήρωση της συγκρότησής τους, οι μεγάλες ριβοσωμικές υπομονάδες απελευθερώνονται από τον πυρηνίσκο και εισέρχονται στο κυτταρόπλασμα. Λειτουργικά, πλήρως συγκροτημένα ριβοσώματα υπάρχουν μόνο στο κυτταρόπλασμα, ενώ στον πυρήνα παρατηρούνται μόνο ξεχωριστές ριβοσωμικές υπομονάδες. Ο σχηματισμός των ριβοσωμικών υπομονάδων στα προκαρυωτικά κύτταρα γίνεται με τον ίδιο μηχανισμό που ισχύει για τα ευκαρυωτικά ριβοσώματα. Τα 16S, 23S και 5S rRNA δημιουργούνται από τη βαθμιαία και ελεγχόμενη αποικοδόμηση του πρόδρομου μορίου 30S RNA.(Εικόνα 4 ) [9]
Εικόνα 4 Η πορεία δημιουργίας ριβοσωμικών υπομονάδων[9]
Εικόνα 5 [5]
Εικόνα 6 Προτεινόμενη δευτεροταγής δομή 16S rRNA[10]
Εικόνα 7 Μοντέλο δευτεροταγούς δομής 18S-rRNA σε μύκητα και η περιοχή εναρκτήριου ζευγαρώματος, B2F και B4F[11]
Εικόνα 8 Δευτεροταγής δομή από ανθρώπινο 5S rRNA[12]
Εικόνα 9 Αλληλεπιδράσεις του 5S rRNA στο ριβόσωμα [13]
Εικόνα 10 Κρυσταλλική δομή του 5S rRNA της E. coli τμήματος περιλαμβάνων V έλικα / E λούπα / IV έλικα / D λούπα με ριβοσωμική πρωτεϊνη L25[13]
Εικόνα 12 Προτεινόμενη δευτεροταγής δομή 8S rRNA[14]
Εικόνα 13 Μοντέλο δευτεροταγούς δομής 23S-rRNA στην Escherichia coli.[15]
Κατηγορίες του ριβoσωμικού RNA
Α.Πρωκαρυωτικά κύτταρα
Υπάρχουν 3 είδη προκαρυωτικών rRNA 1) To 23 S rRNA (2904 νουκλεοτίδια) συστατικό της μεγάλης 50 S ριβοσωμικής υπομονάδας. 2) Το 16 S rRNA (1541 νουκλεοτίδια) συστατικό της μικρής 30 S ριβοσωμικής υπομονάδας. 3) Το 5 S rRNA (120 νουκλεοτίδια) συστατικό της μεγάλης 50 S ριβοσωμικής υπομονάδας. Τα ριβοσωμικά RNA αποτελουν το 80% του ολικού RNA στο προκαρυωτικό κύτταρο.[12]
Β.Ευκαρυωτικά κύτταρα
Τα rRNA των ευκαρυωτικών κυττάρων είναι μεγαλύτερα από των προκαρυωτικών. Εχουμε 4 είδη rRNA: 1) Το 28 S rRNA (4718 νουκλεοτίδια) συστατικό της μεγάλης 60 S ριβοσωμικής υπομονάδας. 2) Το 18 S rRNA (1874 νουκλεοτίδια) συστατικό τη μικρής 40 S ριβοσωμικής υπομονάδας. 3) Το 5,8 S rRNA (160 νουκλεοτίδια) συστατικό της μεγάλης 60 S ριβοσωμικής υπομονάδας. 4) Το 5 S rRNA (120 νουκλεοτίδια) συστατικό της μεγάλης 60 S ριβοσωμικής υπομονάδας. (Εικόνα 2) Τα τρία απ’ αυτά προκύπτουν από μεταμεταγραφική επεξεργασία ενός μεγάλου 45S πρόδρομου rRNA. Aντίθετα το 5 S rRNA αποτελεί μεταγραφικό προϊόν ξεχωριστού γονιδίου. Η αφθονία του ευκαρυωτικού rRNA κυμαίνεται στα ίδια περίπου επίπεδα με εκείνα του ευκαρυωτικού: Συγκεκριμένα, περίπου το 4% του ολικού ευκαρυωτικού κυτταρικού RNA είναι 45 S πρόδρομο rRNA, και το 71% πλήρως επεξεργασμένο rRNA.(Εικόνα 14) [12]
Το rRNA αντιπροσωπεύει το 80% του συνολικού RNA που υπάρχει στο κύτταρο. Το 45% του rRNA βρίσκεται στη μικρή ριβοσωμική υπομονάδα ενώ στη μεγάλη ριβοσωμική υπομονάδα βρίσκεται το 55% του rRNA. Το 18S rRNA της μικρής υπομονάδας των ευκαρυωτικών ριβοσωμάτων έχει ΜΒ 700 kD. Στη μεγάλη ριβοσωμική υπομονάδα υπάρχουν τρία είδη rRNA: το 28S rRNA με ΜΒ 1400 kD, το 5,8S rRNA με ΜΒ 50 kD και το 5S rRNA με ΜΒ 41 kD. Η αλληλουχία των βάσεων ενός δεδομένου τύπου rRNA είναι παρόμοια σε στενά συγγενή είδη. Όμως, μεταξύ φυλογενετικά απομακρυσμένων οργανισμών υπάρχουν πολύ λίγες ομοιότητες στην αλληλουχία βάσεων του συγκεκριμένου rRNA. Ο βαθμός στον οποίον η πρωτοταγής δομή ενός συγκεκριμένου rRNA είναι όμοια μεταξύ δύο διαφορετικών ειδών αντανακλά την εξελικτική ιστορία και τη συγγένεια των οργανισμών. Το 5S rRNA είναι το πλέον εξελικτικά σταθερό απ’ όλα τα είδη rRNA.
Η αλληλουχία βάσεων των διαφόρων rRNA αποκαλύπτει ότι κάθε τύπος περιέχει ανεστραμμένες αλληλουχίες που μπορούν να σχηματίσουν μια μεγάλη ποικιλία “φουρκετών” και άλλων δευτεροταγών δομών. Οι ανεστραμμένες αλληλουχίες του 28S rRNA είναι τόσες πολλές ώστε τα μόρια θα μπορούσαν να πάρουν πάρα πολλές διαμορφώσεις. Το 18S rRNA, π.χ., περιέχει αρκετές ανεστραμμένες αλληλουχίες που μπορούν να δημιουργήσουν 10.000 διαφορετικές δευτεροταγείς δομές. Με ορισμένες εξαιρέσεις, η δευτεροταγής και όχι η πρωτοταγής δομή έχει διατηρηθεί κατά την πορεία της εξέλιξης. Αυτό σημαίνει ότι οι περισσότερες περιοχές που παρουσιάζουν δευτεροταγή δομή, και όχι η πρωτοταγής αλληλουχία των νουκλεοτιδίων, είναι υπεύθυνες για τη συγκρότηση και τη λειτουργία των ριβοσωμάτων.
Χωρίς αμφιβολία όλα τα είδη rRNA έχουν την ικανότητα να αποκτήσουν τριτοταγή διαμόρφωση καθώς συγκροτούνται σε ριβοσώματα. Η λειτουργική σημασία των δευτεροταγών και τριτοταγών διαμορφώσεων στο rRNA παραμένει ουσιαστικά άγνωστη. Είναι όμως πιθανόν οι διαμορφώσεις των rRNA:
α. να αποτελούν τα μοριακά σήματα για την περαιτέρω επεξεργασία των rRNA,
β. να συμβάλλουν στην αναγνώριση τμημάτων των rRNA από ριβοσωμικές πρωτεΐνες κατά τη συγκρότηση του ριβοσώματος,
γ. να συμμετέχουν στη διατήρηση της δομής του ριβοσώματος, και
δ. να προσφέρουν θέσεις αναγνώρισης για τις συνδέσεις που σχηματίζονται μεταξύ ριβοσωμάτων, mRNA, tRNA και τους διάφορους παράγοντες οι οποίοι συμμετέχουν στην πρωτεϊνική σύνθεση.
Οι χημικές τροποποιήσεις που γίνονται στα rRNA είναι σχετικά περιορισμένες και περιλαμβάνουν κυρίως μεθυλίωση των δομικών του συστατικών. Οι τροποποιήσεις αυτές είναι πιθανόν να προστατεύουν τμήματα του rRNA από τη δράση νουκλεασών ή μπορεί να αποτελούν ειδικά σήματα επεξεργασίας για τη σύνδεση των πρωτεϊνών.
Στα ευκαρυωτικά κύτταρα τα 28S, 18S και 5,8S rRNA μεταγράφονται από την RNA πολυμεράση ΙΙ με τη μορφή πρόδρομου rRNA, το μέγεθος του οποίου κυμαίνεται από 37S μέχρι 45S, ανάλογα με το είδος. Η μεταγραφή και η παραπέρα επεξεργασία αυτών των rRNA γίνεται στον πυρηνίσκο. Η διαδικασία για τη δημιουργία των 28S, 18S και 5,8S rRNA ξεκινά ενώ δεν έχει ακόμη τελειώσει η μεταγραφή του μεγάλου πρόδρομου μορίου rRNA. Οι χημικές τροποποιήσεις, κυρίως μεθυλιώσεις, γίνονται πάρα πολύ γρήγορα, σε περιοχές του μορίου που διατηρούνται στα 28S, 18S και 5,8S rRNA. Το τέλος της μεταγραφής ακολουθείται σχεδόν αμέσως από αντιδράσεις που αποκόπτουν και ξεχωρίζουν τα 28S, 18S και 5,8S rRNA από το μεγάλο πρόδρομο μόριο rRNA. Αν και οι θέσεις θραύσης διαφέρουν κάπως στα διαφορετικά είδη, στους περισσότερους οργανισμούς οι αρχικές θραύσεις από τις RNA ενδονουκλεάσες γίνονται κοντά στα
Το 5S rRNA μεταγράφεται από γονίδια εκτός του πυρηνίσκου από την RNA πολυμεράση ΙΙΙ. Η έναρξη της μεταγραφής του γονιδίου 5S rRNA περιλαμβάνει την αλληλεπίδραση ανάμεσα στην RNA πολυμεράση ΙΙΙ, διάφορους παράγοντες μεταγραφής και έναν εσωτερικό προαγωγέα. Δύο από τους παράγοντες αυτούς, οι TFIIIB και TFIIIC είναι γενικοί παράγοντες που συμμετέχουν στην έναρξη μεταγραφής όλων των γονιδίων από την RNA πολυμεράση ΙΙΙ. Αντίθετα, ο παράγοντας TFIIIA, συνδέεται μόνο στα γονίδια 5S και προφανώς αναγνωρίζει εκλεκτικά τα 5S γονίδια που θα μεταγραφούν από την RNA πολυμεράση ΙΙΙ. Στα περισσότερα είδη, δεν παρατηρείται χημική τροποποίηση των δομικών συστατικών του 5S rRNA. [16]
Εικόνα 14. Δομή προκαρυωτικού και ευκαρυωτικού ριβοσώματος.[17]
Για πολλά χρόνια ήταν δεδομένο ότι οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες διεύθυναν τη σύνθεση πρωτεϊνών και ότι το ριβοσωμικό RΝΑ χρησίμευε κυρίως ως δομική σκαλωσιά. Η σημερινή άποψη είναι σχεδόν η αντίστροφη. Ύστερα από την ανακάλυψη του καταλυτικού RΝΑ οι βιοχημικοί δέχονται την πιθανότητα το RΝΑ να παίζει έναν πιο ενεργό ρόλο στη ριβοσωμική λειτουργία. Οι λεπτομερείς δομές καθιστούν σαφές ότι κομβικές θέσεις στο ριβόσωμα αποτελούνται σχεδόν εξ ολοκλήρου από RΝΑ. Η συμβολή των πρωτεϊνών είναι ελάχιστη. Πολλές από τις πρωτεΐνες έχουν επιμήκεις δομές και φαίνεται να έχουν διεισδύσει οφιοειδώς στο μέσον του RΝA Το σχεδόν αναπόφευκτο συμπέρασμα είναι ότι το ριβόσωμα αρχικά αποτελούνταν μόνο από RΝΑ και ότι οι πρωτεΐνες προστέθηκαν αργότερα για τη λεπτή ρύθμιση των λειτουργικών ιδιοτήτων του. Το συμπέρασμα αυτό έχει την ευχάριστη συνέπεια του παραμερισμού του διλήμματος της «κότας ή του αβγού» δηλαδή, πώς είναι δυνατόν να συντίθενται πολύπλοκες πρωτεΐνες τη στιγμή που πολύπλοκες πρωτεϊνες απαιτούνται για τη σύνθεση πρωτεϊνών.[6]
Οι πρωτεΐνες αποτελούν τα ενεργά συστατικά της κυτταρικής μηχανής. Η οργάνωση και η λειτουργία των μηχανισμών πρωτεϊνικής σύνθεσης είναι παρόμοια σε όλα τα κύτταρα: τρία είδη RNA επιτελούν διαφορετικούς αλλά συνεργατικούς ρόλους με τελικό σκοπό τη σύνθεση μιας πρωτεΐνης. Το αγγελιαφόρο RNA (mRNA) κωδικοποιεί τη γενετική πληροφορία που αντιγράφηκε από το DNA με τη μορφή μιας αλληλουχίας βάσεων η οποία καθορίζει μια αλληλουχία αμινοξέων. Το μεταφορικό RNA (tRNA) είναι το κλειδί του κώδικα: τα αμινοξέα που καθορίζονται από την αλληλουχία βάσεων ενός mRNA μεταφέρονται και τοποθετούνται στο άκρο της αυξανόμενης πολυπεπτιδικής αλυσίδας από ειδικά μόρια tRNA. Το ριβοσωμικό RNA (rRNA) συνδέεται με μια ομάδα ειδικών ριβοσωμικών πρωτεϊνών και σχηματίζει το ριβόσωμα, το οποίο είναι η θέση της πρωτεϊνικής σύνθεσης. Τα ριβοσώματα που έχουν τα tRNA και ειδικές πρωτεΐνες μπορούν να κινούνται κατά μήκος ενός μορίου mRNA μεταφράζοντας την κωδικοποιημένη γενετική πληροφορία. Ο όρος μετάφραση αναφέρεται στην όλη διεργασία με την οποίαν η αλληλουχία βάσεων του mRNA χρησιμοποιείται για να ενεργοποιήσει και να συνδέσει τα κατάλληλα αμινοξέα σε μια πρωτεΐνη. Τα νουκλεοτίδια του mRNA “διαβάζονται” ως τριάδες. Κάθε τριάδα νουκλεοτιδίων αποτελεί ένα κωδικόνιο. Κάθε κωδικόνιο καθορίζει ποιο συγκεκριμένο αμινοξύ θα προστεθεί στην αυξανόμενη πολυπεπτιδική αλυσίδα. Οι τρεις τύποι του RNA συμμετέχουν στη διαδικασία αυτή σε όλα τα κύτταρα. Πιστεύεται ότι η ανάπτυξη των τριών ξεχωριστών λειτουργιών του RNA αποτέλεσε το μοριακό κλειδί για την προέλευση της ζωής.
Το ριβόσωμα μπορεί να θεωρηθεί ως κολοσσιαίο ριβοζονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο με πολλαπλές ενεργές θέσεις οι οποίες αναγνωρίζουν και συνδέονται με το mRNA και άλλους απαραίτητους παράγοντες, καταλύοντας έτσι τις αντιδράσεις που του επιτρέπουν να μετακινείται κατά μήκος του mRNA προσθέτοντας, κάθε φορά, ένα αμινοξύ στην αυξανόμενη πολυπεπτιδική αλυσίδα. Κάθε αμινοξύ εισέρχεται στη διαδικασία της πρωτεϊνικής σύνθεσης συνδεδεμένο μ’ ένα μόριο tRNA. Οι αντιδράσεις οι οποίες συνδέουν τα αμινοξέα στα tRNA ονομάζονται ενεργοποίηση του αμινοξέος και αποτελούν την τελική βάση για την ακρίβεια της πρωτεϊνικής σύνθεσης. Αυτό συμβαίνει διότι οι αντιδράσεις ενεργοποίησης, συνδέοντας ένα αμινοξύ μ’ ένα tRNA που έχει ένα αντικωδικόνιο για το αμινοξύ αυτό, συνδέουν άμεσα το κωδικόνιο με το αντίστοιχο αμινοξύ. Κατά την αντίδραση ενεργοποίησης του αμινοξέος, η ενέργεια που απελευθερώνεται από τη θραύση της ΑΤΡ, δεν χάνεται αλλά διατηρείται καθώς τα αμινοξέα συνδέονται στα αντίστοιχα tRNA. Η ενέργεια αυτή, η οποία απελευθερώνεται καθώς τα αμινοξέα μεταφέρονται από τα tRNA στην αυξανόμενη πολυπεπτιδική αλυσίδα, αποτελεί την κύρια δύναμη που καθοδηγεί την πρωτεϊνική σύνθεση. Το σύμπλοκο που σχηματίζεται μεταξύ ενός tRNA και ενός αμινοξέος αποτελεί ένα αμινοακυλ-tRNA. Τα σύμπλοκα αυτά σχηματίζονται με τη συμμετοχή των αμινοακυλ-tRNA συνθετασών. Υπάρχουν είκοσι διαφορετικές αμινοακυλ-tRNA συνθετάσες και κάθε μια συνδέει ένα από τα είκοσι αμινοξέα με τα συμβατά ή συγγενή tRNA. Οι αντιδράσεις που οδηγούν στη συγκρότηση ενός πολυπεπτιδίου διακρίνονται σε τρεις φάσεις:
Α. Κατά την πρώτη φάση, την έναρξη, η μικρή και η μεγάλη ριβοσωμική υπομονάδα συγκροτούνται σε λειτουργικό ριβόσωμα με τη συμμετοχή του mRNA και ενός εξειδικευμένου tRNA που ονομάζεται εναρκτήριο tRNA. Μια σειρά από διάφορους παράγοντες έναρξης ελέγχουν και επιταχύνουν την όλη διαδικασία. Μόλις γίνει η συγκρότηση του ριβοσώματος, μαζί με το mRNA και το εναρκτήριο tRNA, αρχίζει η δεύτερη φάση.
Πώς αρχίζει η σύνθεση των πρωτεϊνών; Η απλούστερη πιθανότητα θα ήταν τα τρία πρώτα νουκλεοτίδια κάθε μορίου mRΝΑ να χρησιμεύουν ως το πρώτο κωδίκιο. Τότε δεν θα χρειαζόταν ένα ειδικό σήμα έναρξης. Ωστόσο, τα πειραματικά δεδομένα δείχνουν ότι η μετάφραση δεν αρχίζει αμέσως από το 5'-άκρο του mRΝΑ Πράγματι, το προπό κωδίκιο που μεταφράζεται βρίσκεται σχεδόν πάντοτε περισσότερο από 25 νουκλεοτίδια μακριά από το 5 -άκρο. Επιπλέον, στα προκαρυωτικά κύτταρα πολλά μόρια mRΝΑ είναι πολυκιστρονικά ή πολυγονιόιακά δηλαδή κωδικεύουν δύο ή περισσότερες πολυπεπτίόικές αλυσίδες. Παραδείγματος χάριν, ένα μόνο μόριο mRΝΑ μήκους 7000 περίπου νουκλεοτιδίων καθορίζει πέντε ένζυμα της βιοσυνθετικής πορείας της θρυπτοφάνης στην Ε. Coli. Κάθε μία από αυτές τις πέντε πρωτεΐνες έχει τα δικά της σημεία έναρξης και τερματισμού στο mRΝΑ. Πράγματι, όλα τα γνωστά μόρια mRΝΑ περιέχουν σήματα τα οποία προσδιορίζουν την αρχή και το τέλος κάθε κωδικευόμενης πολυπεπτιδικής αλυσίδας.
Μια ένδειξη για τον μηχανισμό έναρξης ήταν η ανακάλυψη ότι τα μισά σχεδόν από τα αμινο-τελικά αμινοξέα των πρωτεΐνών της Ε Coli είναι μεθειονίνη. Πράγματι, το εναρκτήριο κωδίκιο στο mRΝΑ είναι ΑUG (μεθειονίνη). ή πολύ σπανιότερα GUG (βαλίνη). Ποιά πρόσθετα σήματα είναι απαραίτητα ώστε να προκύψει μια εξειδικευμένη θέση έναρξης τη; μετάφρασης; Το πρώτο βήμα για την απάντηση στο ερώτημα αυτό ήταν η απομόνωση της περιοχής έναρξης από έναν αριθμό μορίων mRΝΑ. Η απομόνωστη επιτεύχθηκε με τη χρήση παγκρεατικής ριβονουκλεάσης για την πέψη συμπλοκών m RΝΑ ριβοσωμάτων (τα οποία σχηματίστηκαν υπό συνθήκες έναρξης της σύνθεσης αλλά όχι επιμήκυνσης). Σε κάθε μία από τις περιπτώσεις αυτές, μια αλληλουχία 30 περίπου νουκλεοτιδίων προστατευόταν από την πέψη. Όπως αναμενόταν, κάθε περιοχή έναρξης έχει ένα κωδίκιο AUG (ή GUG) (Εικόνα 15 ). Επι-πλέον. κάθε περιοχή έναρξης έχει μια αλληλουχία πλούσια σε πουρίνες, κεντραρισμένη στην περιοχή που βρίσκεται 10 περίπου νουκλεοτίδια από το κωδίκιο έναρξης προς τη μεριά του 5 -άκρου. [18]
Εικόνα 15 Περιοχές έναρξης. Αλληλουχίες mRNA περιοχών έναρξης της σύνθεσης πρωτεϊνών μερικών βακτηριακών και ιϊκων μορίων mRNA Η σύγκριση των αλληλουχιών αυτών αποκαλύπτει ορισμένα επαναλαμβανόμενα χαρακτηριστικά. [18]
Ο ρόλος αυτής της πλούσιας σε πουρίνες περιοχής, η οποία ονομάζεται αλληλουχία Shine-Dalgarno, έγινε προφανής όταν διαλευκάνθηκε η αλληλουχία του rRΝΑ 16 S. Το 3-άκρο αυτού του συστατικ`ού rRNA της υπομονάδας 30 S περιέχει μια αλληλουχία μερικών βάσεων που είναι συμπληρωματικές με την πλούσια σε πουρίνες περιοχή των θέσεων έναρξης των μορίων. mRΝΑ Μεταλλαξιγένεση της αλληλουχίας CCUCC κοντά στο 3'-άκρο του rRNA 16 S σε ACACA παρεμποδίζει σε αξιοσημείωτο βαθμό την αναγνώριση των περιοχών έναρξης του mRΝΑ. Αυτή και άλλες ενδείξεις δείχνουν ότι η περιοχή έναρξης του mRΝΑ δεσμεύεται με το rRNA 16 S πολύ κοντά στο 3' άκρο του. Ο αριθμός των ζευγών βάσεων που συνδέουν το mRΝΑ και το rRNA 16 S ποικίλλει από τρεις έως εννέα. Επομένως, δύο είδη αλληλεπιδράσεων προσδιορίζουν το πού αρχίζει η σύνθεση πρωτεϊνών: (1) το ζευγάρωμα βάσεων του m RΝΑ με το 3'-άκρο του rRΝΑ 16 S και (2) το ζευγάρωμα του κωδικίου έναρξης του mRΝΑ με το αντικωδίκιο του μορίου του εναρκτήριου tRNA.[18]
Β. Κατά τη δεύτερη φάση, την επιμήκυνση, αμινοακυλ-tRNA συνδέονται στο ριβόσωμα μ’ ένα συγκεκριμένο τρόπο που καθορίζεται από την αλληλουχία των βάσεων του mRNA. Η όλη διαδικασία επιταχύνεται από παράγοντες επιμήκυνσης. Τα αμινοξέα μεταφέρονται από τα tRNA στην αυξανόμενη πολυπεπτιδική αλυσίδα.[19]
Το καρβοξυτελικό άκρο της πολυπεπτιδικής αλυσίδας απελευθερώνεται από το tRNA
που βρίσκεται στη θέση Ρ και ενώνεται με πεπτιδικό δεσμό με την ελεύθερη αμινομάδα του αμινοξέος που μεταφέρεται από το tRNA το οποίο βρίσκεται στη θέση Α. Αυτή η κεντρική αντίδραση καταλύεται από το ένζυμο πεπτιδυλοτρανσφεράση η οποία αποτελεί τμήμα του ριβοσώματος. Στην περίπτωση αυτή, το καταλυτικό τμήμα του ριβοσώματος δεν είναι μια από τις πρωτεϊνες του αλλά ένα από τα μόρια του rRNA της μεγάλης υπομονάδας.[20]
Η αντίδραση πεπτιδυλοτρανσφεράσης καταλύεται από το μεγάλο rRNA, το οποίο προσανατολίζει ακριβώς τα άτομα αλληλεπιδρώντας, επιτρέποντας την αντίδραση να προχωρήσει. Η καταλυτική ιδιότητα του μεγάλου rRNA στα βακτήρια έχει καταδειχθεί με προσεκτική αφαίρέση της μεγάλης πλειοψηφίας της πρωτεϊνης από τις μεγάλες ριβοσωματικές υπομονάδες. Το σχεδόν καθαρό βακτηριακό 23S rRNA μπορεί να καταλύσει μια αντίδραση πεπτιδυλοτρανσφεράσης μεταξύ των ανάλογων αμινοάκυλο-tRNA και πεπτιδυλ- tRNA. Η περαιτέρω υποστήριξη για τον καταλυτικό ρόλο του μεγάλου rRNA στην πρωτεϊνική σύνθεση προέρχεται από τις κρυσταλλογραφικές μελέτες που δείχνουν ότι καμία πρωτεϊνη δεν βρίσκεται κοντά στην περιοχή της σύνθεσης πεπτιδικών δεσμών στη κρυσταλλική δομή της μεγάλης βακτηριακής υπομονάδας.[21]
Ο κύκλος επιμήκυνσης συνεχίζεται μέχρις ότου το ριβόσωμα φτάσει στο τέλος του κωδικοποιημένου μηνύματος. Στο σημείο αυτό η διαδικασία εισέρχεται στην τρίτη και τελευταία φάση.
Γ. Στην τρίτη φάση, τον τερματισμό, το mRNA και το ολοκληρωμένο πολυπεπτίδιο απελευθερώνονται και οι ριβοσωμικές υπομονάδες διαχωρίζονται. Η διαδικασία τερματισμού επιταχύνεται από παράγοντες τερματισμού.
Όλες οι φάσεις της πρωτεϊνικής σύνθεσης απαιτούν την κατανάλωση ενέργειας που προέρχεται από την υδρόλυση των ΑΤΡ και GTP. Tόσο η ΑΤΡ όσο και η GTP υδρολύονται κατά τη φάση της έναρξης. Κατά τη φάση της επιμήκυνσης υδρολύονται δύο μόρια GTP για κάθε αμινοξύ που προστίθεται στην πολυπεπτιδική αλυσίδα. Η φάση του τερματισμού απαιτεί επίσης την υδρόλυση GTP. [19]
[1] MΑΡΜΑΡΑΣ Β., ΛΑΜΠΡΟΠΟΥΛΟΥ–MΑΡΜΑΡΑ Μ., Kυτταρική Bιολογία, Τόµος A', Θεµατική Ενότητα: ∆ΟΜΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΟΥ KΥΤΤΑΡΟΥ, ΠATPA 2000, σελ.240-241.
[2] Γεωργάτσος Ι.,Μοριακή βιολογία, Τόμος Γ, Ε.Α.Π. 2001,σελ.203
[3] Lodish H.et all, Molecular cell biology, fifth edition, p.442
[4] Lodish H.et all, Molecular cell biology, fifth edition, p.525
[5] Γεωργάτσος Ι.,Μοριακή βιολογία, Τόμος Γ, Ε.Α.Π. 2001,σελ.36
[6] Berg J., Tymoczko J., Stryer L., Βιοχημεία, Τόμος ΙΙ, Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, Ηράκλειο 2005, σελ. 927.
[7] http://www-jcb.bio.auth.gr/mor_biol/ribosomes/frames/rib1.htm
[8] http://www-jcb.bio.auth.gr/mor_biol/ribosomes/texts/ribosomes8.htm
[9] http://www-jcb.bio.auth.gr/mor_biol/ribosomes/texts/ribosomes9.htm
[12] Biochem. J. (2003) 371 (641–651) (Printed in Great Britain), 5S rRNA: structure and interactions, Maciej SZYMASKI, Mirosawa Z. BARCISZEWSKA, Volker A. ERDMANN and Jan BARCISZEWSKΙ, Institute of Bioorganic Chemistry, Polish Academy of Sciences, Noskowskiego 12, 61704 Poznan, Poland, and Institute of Chemistry/Biochemistry, Free University Berlin, Thielallee 63, 14195 Berlin, Germany.
[13] www.biochemj.org/bj/371/0641/bj3710641.htm
[14] www.binf.ku.dk/.../1/12/RRNA.png/180px-RRNA.png
[15] www.biomedcentral.com/1471-2105/3/2/figure/F2
[16] http://www-jcb.bio.auth.gr/mor_biol/ribosomes/texts/ribosomes3.htm
[17] Κατσώρης Π., Μοριακή βιολογία Εναλλακτικό διδακτικό υλικό για τη θεματική ενότητα: Οργάνωση της ύλης σε έμβια όντα ,Ε.Α.Π 2005, σελ 74.
[18] Berg J., Tymoczko J., Stryer L., Βιοχημεία, Τόμος ΙΙ, Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, Ηράκλειο 2005, σελ. 928-929.
[19] http://www-jcb.bio.auth.gr/mor_biol/ribosomes/texts/ribosomes14.htm
[20] Alberts, Bray, Johnson, Lewis, Raff, Roberts, Walter, Βασικές Αρχές Κυτταρικής Βιολογίας, Εισαγωγή στην Μοριακή Βιολογία του Κυττάρου, Ιατρικές Εκδόσεις Π.Χ. Πασχαλίδης, σελ.266-267.
[21] Lodish H.et all, Molecular cell biology, fifth edition, p.128
18. Τι είναι τα ριβόζυμα και η σημασία τους στην επιστήμη της εξέλιξης;
Να γίνει και σχέδιο μαθήματος σε μαθητές Β' και Γ' λυκείου.
Κάθε χημική αντίδραση χαρακτηρίζεται από μια ταχύτητα με την οποία πραγματοποιείται. Οι περισσότερες από αυτές, που συμβαίνουν στα διάφορα βιολογικά συστήματα, επιταχύνουν αυτήν την ταχύτητά τους, έτσι ώστε να εξοικονομείται ενέργεια και πολύτιμος χρόνος. Ένας από τους τρόπους για να επιτευχθεί αυτό, είναι όταν οι αντιδράσεις καταλύονται από ένζυμα, τα οποία μπορούν να ορισθούν ως τα μακρομόρια εκείνα, που α) επιταχύνουν το ρυθμό μιας αντίδρασης διαμέσου ενός εναλλακτικού μονοπατιού, που απαιτεί χαμηλότερη ενέργεια ενεργοποίησης των συμμετεχόντων στην αντίδραση μορίων, β) είναι υψηλά εξειδικευμένα ως προς τα υποστρώματα πάνω στα οποία ενεργούν και τα προϊόντα τα οποία δημιουργούν και γ) δεν καταναλώνονται ή μετατρέπονται σε ανενεργή μορφή, έτσι ώστε ένα ενζυμικό μόριο μπορεί συνεχώς να επεξεργάζεται πολλά μόρια υποστρώματος. Η βιολογική κατάλυση για πολλά χρόνια θεωρούνταν ότι προάγονταν αποκλειστικά από πρωτεϊνικά ένζυμα. Την τελευταία δεκαπενταετία όμως έγιναν διάφορες ανακαλύψεις που εδραίωσαν το RNA ως ένα βιολογικό καταλύτη. Αυτές ήταν, η ανακάλυψη ότι ορισμένα μόρια RNA μεσολαβούν ώστε να επιτευχθεί η δική τους διάσπαση με αποτέλεσμα την ωρίμανσή τους από ολιγομερή σε μονομερή, ενώ κάποια άλλα μόρια RNA μπορούσαν να προάγουν την διάσπαση και άλλων υποστρωμάτων-RNA, όπως στην περίπτωση του αυτοωριμαζόμενου πυρηνικού ριβοσωμικού RNA (ribosomal RNA, rRNA) εσωνίου του πρωτοζώου Tetrahymena thermophila και των καταλυτικών ιδιοτήτων διάσπασης από το μόριο RNA της ριβονουκλεάσης-Ρ (RNaseP). Το RNA λοιπόν είναι το πρώτο γνωστό μόριο με διπλό σημαντικό ρόλο, δηλαδή να μπορεί να αποθηκεύει γενετική πληροφορία, όπως επίσης και να προάγει χημικές αντιδράσεις. Μπορεί να αποκτά πολύπλοκες τριτοταγείς δομές, που πιστεύεται ότι είναι το κλειδί της καταλυτικής του ενεργότητας και παρά την ομοιότητά του με το DNA, η 2' υδροξυλομάδα της ριβόζης προσδίδει στο μόριο του RNA μια εξέχουσα ικανότητα να συμμετέχει σε καταλυτικές αντιδράσεις. Καταλυτικά RNA έχουν αναγνωρισθεί μέχρι σήμερα σε διάφορα βιολογικά συστήματα, ενώ σε εκείνες τις αλυσίδες του RNA, που κατέχουν ενζυμικές ιδιότητες έχει αποδοθεί η ονομασία "RNA ένζυμα" ή "ριβόζυμα". Αυτά κατατάσσονται σε τρείς κύριες κατηγορίες, στις οποίες το RNA συμμετέχει όχι μόνο σαν υπόστρωμα αλλά και σαν καταλύτης, όπως:
1) των αυτοωριμαζόμενων εσωνίων, που περιλαμβάνει:
α) τα εσώνια της ομάδας Ι και
β) τα εσώνια της ομάδας ΙΙ,
2) των καταλυτικών RNA που βρίσκονται σε σύμπλοκα RNA/πρωτεϊνών, που περιλαμβάνει:
α) την ριβονουκλεάση-Ρ (RNaseP),
β) το σωμάτιο ωρίμανσης (splicosome), που αποτελεί την χαρακτηριστική αναγκαία δομή για την πραγματοποίηση της διαδικασίας ωρίμανσης των πυρηνικών προ-mRNA,
γ) το ριβοσωμικό RNA (rRNA) που αποτελεί τμήμα του συμπλόκου rRNA και πρωτεϊνών στο ριβόσωμα και
3) τα RNA που, όπως και σε μερικές από τις προηγούμενες κατηγορίες, καταλύουν την αντίδραση διάσπασης σε συγκεκριμένη θέση, αλλά έχουν και κάποια ιδιαίτερα δομικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά γνωρίσματα, έτσι ώστε να συνιστούν μια ξεχωριστή γενική κατηγορία. Περιλαμβάνει:
α) το ριβόζυμο του ιού της ηπατίτιδας δέλτα (Hepatitis Delta Virus, HDV),
β) τα ριβόζυμα τύπου "φουρκέτας" ή "φουρκετοειδή" (hairpin) ριβοένζυμα
γ) τα ριβόζυμα "σφυροκέφαλου" τύπου ή "σφυροκέφαλα" (hammerhead) ριβόζυμα. [1]
Τα γονίδια των ευκαρυωτικών οργανισμών, που περιέχουν κωδικοποιημένη την πληροφορία για την σύνθεση μιας πρωτείνης, συχνά διακόπτονται από αλληλουχίες βάσεων που ονομάζονται, "παρεμβαλόμενες αλληλουχίες" (intervening sequences, IVS) ή "εσώνια" (introns). Αντίθετα, οι περιοχές του DNA που περιέχουν κωδικοποιημένη πληροφορία και διακόπτονται από εσώνια, ονομάζονται "εξώνια" (exons). Τα ένζυμα RNA πολυμεράσες, που πραγματοποιούν την μεταγραφή, δηλαδή την παραγωγή RNA από μήτρα DNA, μεταγράφουν και τα εξώνια και τα εσώνια σε ένα μεγάλο πρόδρομο μόριο RNA. Τα εσώνια στη συνέχεια απομακρύνονται μέσω μιας διαδικασίας που είναι γνωστή ως "ωρίμανση του RNA". Είναι μια πολύπλοκη διαδικασία, η οποία απαιτεί την αναγνώριση μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας στο μόριο του RNA, διάσπαση της πολυριβονουκλεοτιδικής αλυσίδας και συγκόλλησή της σε μια διαφορετική θέση. Μια τέτοια διαδικασία όμως πρέπει να είναι και πολύ ακριβής. Οποιαδήποτε ανακρίβεια, για παράδειγμα στην ωρίμανση του προ-mRNA, θα κατάστρεφε το πλαίσιο διαβάσματος (reading frame) για την σύνθεση μιας πρωτείνης, ενώ ανακρίβεια στην ωρίμανση του προ-rRNA και προ-tRNA θα δημιουργούσε μη λειτουργικά ριβοσώματα και μόρια tRNA. (Εικόνα 1) Μέχρι σήμερα έχουν αναγνωρισθεί δύο κατηγορίες εσωνίων, με βάση τα δομικά τους στοιχεία, καθώς και του μηχανισμού με τον οποίο πραγματοποιείται η αντίδραση της ωρίμανσης του RNA. Αυτές είναι α) των αυτοωριμαζόμενων εσωνίων της ομάδας Ι και β) των αυτοωριμαζόμενων εσωνίων της ομάδας ΙΙ. Τα βασικά τους χαρακτηριστικά αναλύονται αμέσως παρακάτω.[1]
Εικόνα 1 [2]
Τα εσώνια της ομάδας Ι συναντώνται σε διάφορους ζωϊκούς και φυτικούς οργανισμούς, όπως: στο πυρηνικό rRNA του πρωτοζώου Tetrahymena thermophila και του Physarum polycephalum, σε χλωροπλαστικά tRNA γονίδια από καλαμπόκι και φασόλι, σε μιτοχόνδρια μυκήτων, όπως του Podospora anserina, στο προ-mRNA του κυτοχρώματος b του μύκητα Neurospora crassa, στο προ-rRNA και στο προ-mRNA της κυτοχρωμικής οξειδάσης της ζύμης. Ο μηχανισμός της αντίδρασης έγινε γνωστός από τις εργασίες του Cech και των συνεργατών του. Όπως δείχθηκε αρχικά για το εσώνιο του rRNA του πρωτοζώου Tetrahymena thermophila, η αντίδραση της αυτοωρίμανσης του εσωνίου πραγματοποιείται μέσω δύο αντιδράσεων τρανσεστεροποίησης (transesterification). Στο πρώτο στάδιο γίνεται διάσπαση στην 5' θέση ωρίμανσης (
Εικόνα 2 Το γραμμικό εσώνιο μπορεί να καταλύει την αντίδραση διάσπασης μορίου RNA, που μπορεί να δεσμεύεται στην ειδική θέση XYZ μέσω των συμπληρωματικών του βάσεων X'Y'Z'.[1]
Τα εσώνια της ομάδας ΙΙ έχουν βρεθεί στα οργανίδια μυκήτων και φυτών, όπως στο μιτοχονδριακό προ-mRNA της κυτοχρωμικής οξειδάσης του ζυμομύκητα, σε φυτικούς χλωροπλάστες και τελευταία στο μονοκύτταρο χλωροφύκος Chlamydomonas reinhardtii. Ο μηχανισμός ωρίμανσης πραγματοποιείται και εδώ μέσω δυο συνεχόμενων αντιδράσεων τρανσεστεροποίησης (Εικόνα 3). Διαφέρει από αυτόν της ομάδας Ι, ως προς την υδροξυλομάδα που συμμετέχει στο πρώτο στάδιο της ωρίμανσης. Δηλαδή, ενώ στα εσώνια της ομάδας Ι υπεύθυνη για το ξεκίνημα της αντίδρασης είναι η 3'-υδροξυλομάδα μιας εξωγενούς γουανοσίνης, στα εσώνια της ομάδας ΙΙ είναι η 2'-υδροξυλομάδα μιας αδενοσίνης, που βρίσκεται κοντά στο 3' άκρο του εσωνίου. Αυτή η 2'-υδροξυλομάδα της αδενοσίνης είναι που συμμετέχει στην διάσπαση στην 5' θέση ωρίμανσης με ταυτόχρονο σχηματισμό ενός 2'-5' φωσφοδιεστερικού δεσμού με το πρώτο νουκλεοτίδιο του εσωνίου. Έτσι το εσώνιο σχηματίζει μια δομή βρόγχου (lariat) χαρακτηριστική για την διαδικασία ωρίμανσης των εσωνίων της ομάδας ΙΙ και των πυρηνικών προ-mRNA. Στο δεύτερο στάδιο η 3'-υδροξυλομάδα στο 3' άκρο του ήδη ελεύθερου εξωνίου συμμετέχει στην διάσπαση στην 3' θέση ωρίμανσης. Ακολουθεί συγκόλληση των εξωνίων και απελευθέρωση του εσωνίου με την προσχηματισθείσα δομή βρόγχου.[1]
Εικόνα 3. Η διαδικασία ωρίμανσης των αυτοωριμαζόμενων εσωνίων της ομάδας ΙΙ. Τα σύμβολα 5' θω και 3' θω δείχνουν την 5' και 3' θέση ωρίμανσης αντίστοιχα.[1]
Η ριβονουκλεάση-Ρ έχει βρεθεί στα βακτήρια Escherichia coli, Bacillus subtilis και Salmonella typhimurium (Εικόνα 4Α). Είναι μια ενδοριβονουκλεάση η οποία διασπά πρόδρομα μόρια tRNA για να δημιουργήσει το 5' άκρο των ώριμων tRNA (Σχήμα 4Β). Επίσης είναι το πρώτο ένζυμο που βρέθηκε να αποτελείται από μια αλυσίδα RNA μήκους 400 νουκλεοτιδίων, άκρως απαραίτητη για την καταλυτική ικανότητα του ενζύμου, καθώς και μια πρωτεϊνική υπομονάδα περίπου 14 kDa. Το μόριο του RNA είναι ικανό από μόνο του να καταλύει in vitro την αντίδραση ωρίμανσης του tRNA παρουσία υψηλών συγκεντρώσεων Mg2+, αλλά για την ενεργότητα του ενζύμου in vivo είναι άκρως απαραίτητη και η πρωτεϊνική υπομονάδα. Ο μηχανισμός της αντίδρασης δεν είναι ακόμα γνωστός, αλλά είναι σίγουρο ότι για να πραγματοποιηθεί χρειάζεται οπωσδήποτε την παρουσία ιόντων Mg2+, ενώ πρόσφατα αναγνωρίστηκαν στην δευτεροταγή δομή της RNA υπομονάδας της ριβονουκλεάσης-Ρ από την E. coli, περιοχές νουκλεοτιδίων, όπως από 60-92, 230-260 και 290-360, σαν απαραίτητες για την καταλυτική ικανότητα του μορίου.[1]
Η ωρίμανση των εσωνίων στα πυρηνικά προ-mRNA βρέθηκε ότι γίνεται με την βοήθεια του ονομαζόμενου σωματίου ωρίμανσης. Απομονώθηκε από τα in vitro συστήματα μελέτης της όλης αντίδρασης ωρίμανσης, σαν ένα ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο μεγέθους 50-60 S. Αποτελείται από μόρια RNA, τα αποκαλούμενα μικρά πυρηνικά RNA (small nuclear RNAs, snRNAs) καθώς και πρωτείνες. Τα μικρά πυρηνικά RNA είναι σταθερά, σχετικά άφθονα μόρια που βρίσκονται στον πυρήνα αρκετών ευκαρυωτικών οργανισμών, με μήκος 90 έως 220 νουκλεοτίδια. Κάθε μικρό πυρηνικό RNA υπάρχει σαν ένα σύμπλοκο με αρκετές πρωτείνες σχηματίζοντας έτσι ένα ξεχωριστό μικρό πυρηνικό ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο (small nuclear RNP, snRNP) Μέχρι σήμερα, ως συμμετέχοντα στο σωμάτιο ωρίμανσης και στην όλη διαδικασία, έχουν αναγνωριστεί τα U1 snRNP, U2 snRNP, U4 snRNP, U5 snRNP και U6 snRNP.[1]
Εικόνα 4. (Α) Προτεινόμενη δευτεροταγής δομή της RNA υπομονάδας (M1 RNA) της ριβονουκλεάσης P από E. coli. Οι αριθμοί υποδηλώνουν συγκεκριμένες νουκλεοτιδικές θέσεις. Τα νουκλεοτίδια από: 60-92, 230-260 και 290-360, παίζουν σημαντικό ρόλο στον καθορισμό της θέσης διάσπασης, αλλά και της ταχύτητας της αντίδρασης διάσπασης από την ριβονουκλεάση P. (Β) Δευτεροταγής δομή ενός πρόδρομου μορίου tRNA. Το βέλος δείχνει την θέση διάσπασης στο πρόδρομο tRNA.[1]
Ο μηχανισμός με τον οποίο πραγματοποιείται η αντίδραση ωρίμανσης των πυρηνικών προ-mRNA είναι ο ίδιος με αυτόν των αυτοωριμαζόμενων εσωνίων της ομάδας ΙΙ, που περιγράφτηκε παραπάνω. Μια τέτοια ομοιότητα οδήγησε στην άποψη ότι αυτές οι δυο διαδικασίες συγγενεύουν εξελικτικά. Έχουν βρεθεί συγκεκριμένες αντιστοιχίες, μεταξύ δομών που δημιουργούνται από τις αλληλεπιδράσεις ορισμένων περιοχών των εσωνίων της ομάδας ΙΙ με τα εξώνια καθώς και των ανάλογων δομών που σχηματίζονται και των αλληλεπιδράσεων των μικρών πυρηνικών RNA U1, U2 και U5 με περιοχές των εσωνίων και των εξωνίων του προ-mRNA. Η συγγένεια όμως μεταξύ των δυο μηχανισμών υπονοεί επίσης ότι, τουλάχιστον μερικά από τα μικρά πυρηνικά μόρια RNA που αποτελούν συστατικά του σωματίου ωρίμανσης, έχουν καταλυτικές ιδιότητες. Πράγματι, βρέθηκε ότι το U6 snRNA πολύ πιθανόν να έχει τέτοιες ιδιότητες, αφού μεταλλάξεις σε ορισμένες περιοχές του μορίου αυτού, εμπόδιζαν την πραγματοποίηση της δεύτερης αντίδρασης τρανσεστεροποίησης στην διαδικασία ωρίμανσης Οι ίδιοι ερευνητές υποθέτουν, ότι λόγω της συνεξέλιξης των snRNAs με τις αντίστοιχες πρωτείνες στο σωμάτιο ωρίμανσης, θα είναι πολύ δύσκολο να δειχθεί ότι αυτά τα μικρά μόρια RNA μπορούν να έχουν αποκλειστικά από μόνα τους τις καταλυτικές ιδιότητες που θα τους επιτρέψουν να πραγματοποιήσουν την αντίδραση ωρίμανσης σε πυρηνικά προ-mRNA.[1]
Το ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο του ριβοσώματος είναι ως γνωστόν άκρως απαραίτητο για την πραγματοποίηση της μετάφρασης του mRNA. Πρόσφατες μελέτες όμως έδειξαν ότι, το RNA συστατικό αυτού του συμπλόκου είναι ικανό από μόνο του να καταλύει συγκεκριμένη αντίδραση στην διαδικασία της πρωτεϊνοσύνθεσης. Πιο συγκεκριμένα, μέχρι σήμερα γνωρίζαμε ότι ο σχηματισμός του πεπτιδικού δεσμού μεταξύ δύο αμινοξέων καταλύεται από το ένζυμο πεπτίδυλο τρανσφεράση που βρίσκεται στην 50S ριβοσωμική υπομονάδα. Όταν τέτοιες ριβοσωμικές υπομονάδες από κύτταρα του Thermus aquaticus (Εικόνα 5) επωάστηκαν με SDS, πρωτεϊνάση Κ και φαινόλη, διαδικασία που απομάκρυνε το 95% των πρωτεϊνών από το σύμπλοκο, το 80% τις ενεργότητας τις πεπτίδυλο-τρανσφεράσης υπήρχε ακόμα. Αυτή η ενεργότητα ήταν ακόμα ευαίσθητη στην χλωραμφενικόλη και την καρβομυκίνη, δυο ειδικούς αναστολείς τις, καθώς και στην επώαση με ριβονουκλεάση Τις1. Τα παραπάνω ευρήματα είναι τα πρώτα πειραματικά δεδομένα που μαρτυρούν τις καταλυτικές ιδιότητες του ριβοσωμικού RNA.[1]
Η ενεργοποίηση των αμινοξέων και η επακόλουθη σύνδεση τους με τα tRNA καταλύονται από ειδικές συνθετάσες των αμινοακυλο-tRNA, οι οποίες επίσης καλούνται ενεργοποιητικά ένζυμα. Οι συνθετάσες των αμινοακυλο-tRNA είναι εξαιρετικά επιλεκτικά ένζυμα ως προς την αναγνώριση τόσο του αμινοξέος που πρόκειται να ενεργοποιηθεί όσο και του δέκτη tRNA.
Ο δρόμος που ακολουθεί το tRNA δια μέσου του ριβοσωματος για την παραγωγή ενός πολυπεπτιδίου (πρωτεΐνης) είναι Α θέση---P θέση---Ε θέση. Η θέση Ε είναι αυτή η οποία είναι η θέση εξόδου του tRNA που ήταν προηγουμένως στην θέση P.
Η απουσία λοιπόν των ενζύμων ενεργοποίησης και απενεργοποίησης τα οποία είναι ειδικά ένζυμα για κάθε αμινοξύ, peptidyl-tRNA, aminoacyl-tRNA , οδηγεί στην παραμονή ενός η περισσοτέρων tRNA στο τελικό προϊόν της πρωτεΐνης ώστε να καθιστά την πρωτεΐνη ελαττωματική.
Δηλαδή εν κατακλείδι στο τελικό προϊόν της πρωτεΐνης αντί να περιέχει μόνο τα απαραίτητα αμινοξέα τα οποία την ταυτοποιούν περιέχει και σε κάποιο σημείο η κάποια σημεία της πρωτεΐνης και ένα η περισσότερα tRNA τα οποία δεν αποκολήθησαν από το τελικό προϊόν της πρωτεΐνης (Εικόνα 5) με αποτέλεσμα το τελικό προϊόν της πρωτεΐνης να είναι ελαττωματικό και να μην μεταφέρει το ίδιο μήνυμα στο κύτταρο,με αποτέλεσμα να αποσυντονίζεται όλη η μιτωτικη διαδικασία.
Εικόνα 5 [3]
είναι σαφές ότι 23S rRNA παρέχει όλες τις καταλυτικές ομάδες για τη peptidyl transferase αντίδραση, δηλ. το ριβόσωμα είναι ένα ribozyme. Αυτό το ισχυρό συμπέρασμα πρόκυψε από τον προσδιορισμό δομών υπομονάδων 50S σε αυτά τα ριβοένζυμα. Πιστεύουμε ότι εάν ανιχνεύσουμε τα πάρα κάτω ένζυμα στον ορό πλάσματος ασθενών με καρκίνο και συγκρίνομε τα αποτελέσματα με αυτά υγιών ατόμων θα παρατηρήσουμε σημαντικές αποκλίσεις στις τιμές σε κάποιο από αυτά τα ένζυμα οι μειωμένες τιμές των οποίων πιθανόν να διαφέρουν από μια μορφή καρκίνους σε μια άλλη, η ακόμη να είναι διαφορετικό το ένζυμο από έναν τύπο καρκίνου σε έναν άλλο. Έτσι λοιπόν από ένα καθ όλα φυσιολογικό DNA με φυσιολογική έκφραση όλων των γονίδιων του έχουμε παραγωγή ελαττωματικών πρωτεϊνών λόγω ελλείψεων ορισμένων ενζύμων απενεργοποίησης. [3]
Εικόνα 5.[4]
Μερικά μόρια RNA που συναντώνται στη φύση έχουν την ικανότητα να αυτοκαταλύουν in vitro την διάσπασή τους από ολιγομερή σε μονομερή. Τέτοια ριβόζυμα έχουν βρεθεί σε ορισμένα φυτικά παθογόνα που ονομάζονται ιοειδή (viroids) και πολλαπλασιάζονται στο φυτικό κύτταρο ανεξάρτητα από την παρουσία ιού, στο δορυφορικό RNA ορισμένων φυτικών ιών που χρειάζονται όμως για να αντιγραφούν την παρουσία του ιού που συνοδεύουν στη φύση, στα μετάγραφα ορισμένων συνεχόμενων (tandem) επαναλαμβανόμενων νουκλεοτιδικών αλληλουχιών του δορυφορικού DNA 2 της σαύρας (newt) και στον ιό της ηπατίτιδας δέλτα. Όλα τα πειραματικά δεδομένα δείχνουν, ότι το κυκλικό RNA των φυτικών παθογόνων αντιγράφεται in vivo μέσω του μηχανισμού του κυλιόμενου κύκλου (rolling circle) (Εικόνα 6). Κατά την διάρκεια της αντιγραφής κυκλικά μόρια του RNA χρησιμοποιούνται σαν μήτρες, οπότε και παράγονται πολυμερή γραμμικά μόρια RNA, τα οποία καταλύουν την διάσπαση του εαυτού τους σε συγκεκριμένη θέση για να παραχθούν τα μονομερή μόρια RNA. Τα τελευταία, αφού κυκλοποιηθούν αν χρειάζεται, αποτελούν τους απογόνους του αρχικού παθογονικού μορίου RNA που αντιγράφηκε. Στη συγκεκριμένη θέση διάσπασης του RNA είναι χαρακτηριστικό ότι δημιουργείται ένα 5'-ΟΗ και ένας 2'-3' κυκλικός φωσφοδιεστερικός δεσμός (Εικόνα 7).[1]
Οι τρείς διαφορετικές υποκατηγορίες καταλυτικών RNA, που ανήκουν σε αυτή την κατηγορία και που είναι: α) το ριβόζυμο του ιού της ηπατίτιδας δέλτα (Hepatitis Delta Virus, HDV), β) τα ριβόζυμα του τύπου "φουρκέτας" ή "φουρκετοειδή" (hairpin) ριβόζυμα και γ) τα ριβόζυμα του "σφυροκέφαλου" τύπου ή "σφυροκέφαλα" (hammerhead) ριβόζυμα, διαχωρίσθηκαν αρχικά με βάση την διαφορετική δευτεροταγή δομή που παίρνει το μόριο του ριβοζύμου, αλλά και από στοιχεία του μηχανισμού τους που ανακαλύφθηκαν.[1]
Εικόνα 6. Μηχανισμός του κυλιόμενου κύκλου για την αντιγραφή μικρών, κυκλικών παθογονικών μορίων RNA. (Α) Μηχανισμός κατά τον οποίο τόσο το θετικής (+) όσο και το αρνητικής (-) πολικότητας RNA καταλύουν την διάσπαση του εαυτού τους. (Β) Μηχανισμός κατά τον οποίο μόνο το θετικής (+) πολικότητας RNA καταλύει την διάσπαση του εαυτού του. Τα βέλη δείχνουν τις θέσεις διάσπασης του πολυμερούς RNA για την δημιουργία των μονομερών, που αποτελούν τους απογόνους του αρχικού μορίου που αντιγράφηκε.[1]
Εικόνα 7. Η αντίδραση διάσπασης του RNA καταλυόμενη από το ίδιο το RNA παρουσία ιόντων Mg2+ ή άλλων δισθενών κατιόντων. Είναι μια μη υδρολυτική αντίδραση τρανσεστεροποίησης και είναι θεωρητικά αντιστρεπτή. Τα γράμματα Β1 και Β2 συμβολίζουν δυο τυχαίες βάσεις στο μόριο του RNA, μεταξύ των οποίων πραγματοποιείται η αντίδραση διάσπασης.[1]
Ο ιός της ηπατίτιδας δέλτα (HDV) προσβάλλει ανθρώπινα κύτταρα και το γενετικό υλικό μέσα στο καψίδιό του είναι ένα μονόκλωνο κυκλικό μόριο RNA μήκους 1700 βάσεων, που θεωρείται αρνητικής πολικότητας [(-) HDV RNA, ενώ το θετικής πολικότητας RNA [(+) HDV RNA] περιέχει μια περιοχή που κωδικοποιεί για τα 195 αμινοξέα του HDV αντιγόνου μέσα στο ιοσωμάτιο Όλα τα δεδομένα δείχνουν ότι το HDV RNA αντιγράφεται με τον μηχανισμό του κυλιόμενου κύκλου, αφού σε μολυσμένους ιστούς βρέθηκαν ολιγομερή HDV RNAς, τόσο θετικής όσο και αρνητικής πολικότητας γεγονός που υπονοεί επίσης ότι απαιτείται διάσπαση των ολιγομερών σε μονομερή μετά την διαδικασία της αντιγραφής. Πράγματι, βρέθηκε ότι τόσο τα (+) όσο και τα (-) HDV RNA ολιγομερή έχουν την ικανότητα να αυτοκαταλύουν την διάσπασή τους, σε in vitro συνθήκες παρουσία ιόντων Mg2+, με ταυτόχρονη δημιουργία ενός 5'-ΟΗ και ενός 2'-3' φωσφοδιεστερικού δεσμού στα προϊόντα της αντίδρασης Τα παραπάνω RNA βρέθηκε επίσης ότι έχουν την ικανότητα να σχηματίζουν δευτεροταγείς δομές, που διαφέρουν από αυτές των φουρκετοειδών ριβοζύμων ή των σφυροκέφαλων, που περιγράφονται αμέσως παρακάτω. Μπορούν δηλαδή να αναδιπλωθούν με τέτοιο τρόπο, ώστε να σχηματίσουν τις χαρακτηριστικές εκείνες δομές που ονομάζονται "ψευδοκόμποι" (pseudoknots), που ίσως να είναι και η καταλυτικά ενεργή μορφή του RNA (Εικόνα 8Α,8Β,9)[5]
Εικόνα 8 (Α) 3D δομή του ρυβόζυμου. (Β)Γενικός μηχανισμός της κατάλυσης του ριβόζυμου [5]
Εικόνα 9 Μονοπάτι αντιγραφής του HDV [5]
Τα "φουρκετοειδή" ριβόζυμα βρέθηκαν στο αρνητικής πολικότητας (-) δορυφορικό RNA του ιού που προκαλεί δακτυλιδωτές κηλίδες στον καπνό (satellite Tobacco Ringspot Virus, sTobRV). Το όνομά τους προέκυψε από μια χαρακτηριστική δευτεροταγή δομή που συναντάται γύρω από τη θέση διάσπασης του RNA, η οποία είναι στην 5' πλευρά του τρινουκλεοτιδίου GUC και για τον σχηματισμό αυτής της δομής συμμετέχουν νουκλεοτιδικές αλληλουχίες από δυο απομακρυσμένες περιοχές του ίδιου μορίου RNA (Εικόνα 10). Η φουρκετοειδής δομή όμως μπορεί να διαχωρισθεί στην περιοχή του υποστρώματος που αποτελείται από 14 νουκλεοτίδια και στην καταλυτική περιοχή που αποτελείται από 50 νουκλεοτίδια [1]
Εικόνα 10. Η προτεινόμενη δευτεροταγής δομή των φουρκετοειδών ριβοζύμων. [6]
Με μεταλλαξιγένεση στο υπόστρωμα και στην καταλυτική περιοχή, αναγνωρίστηκαν συγκεκριμένα άκρως αναγκαία νουκλεοτίδια για την πραγματοποίηση της αντίδρασης, όπως στις περιοχές του κορμού III και IV, ενώ με πειράματα κινητικής χρησιμοποιώντας το ριβόζυμο μήκους 50 νουκλεοτιδίων και υπόστρωμα μήκους 14 νουκλεοτιδίων μετρήθηκαν οι πολύ καλές τιμές: kcat= 2.1/λεπτό και Km= 0.03 μΜ .Η καταλυτική περιοχή έχει μια μονόκλωνη περιοχή στο 5' άκρο της, όπου δεσμεύεται το υπόστρωμα με ζευγάρωμα μεταξύ των συμπληρωματικών βάσεων δια μέσου Watson-Crick δεσμών. Η γουανοσίνη στην 3' πλευρά της θέσης διάσπασης είναι άκρως απαραίτητη, αφού η 2-αμινομάδα της πιστεύεται ότι συμμετέχει στο σχηματισμό μιας ενεργής θέσης για κατάλυση, σε συνδυασμό με το κοντινό ριβονουκλεοτίδιο στην 5' πλευρά της θέσης διάσπασης, η φύση του οποίου δεν έχει τόση σημασία όσο το 2'-ΟΗ του [1]
Η τελευταία υποκατηγορία των RNA με ιδιαίτερα δομικά και λειτουργικά γνωρίσματα, που καταλύουν την αντίδραση διάσπασης του εαυτού τους ή άλλου μορίου RNA σε συγκεκριμένη θέση και που αποτελεί το αντικείμενο μελέτης της παρούσας διατριβής, είναι αυτή των "σφυροκέφαλων" ριβοζύμων. Σ' αυτήν ανήκουν, το κυκλικό μόριο RNA του ιοειδούς του αβοκάντο (Avocado Sun Blotch Viroid, ASBVd) και του λανθάνοντος μωσαϊκού της ροδακινιάς (Peach Latent Mosaic Viroid, PLMVd), του δορυφορικού RNA του ιού της μηδικής (satellite Lucerne Transient Streak Virus, sLTSV) και του δορυφορικού RNA του ιού του καπνού που προξενεί δακτυλιωτές κηλίδες (satellite Tobacco Ringspot Virus, sTobRV), καθώς και τα RNA μετάγραφα ορισμένων συνεχόμενων επαναλαμβανόμενων νουκλεοτιδικών αλληλουχιών του δορυφορικού DNA της σαύρας (newt) . Αυτά τα μόρια RNA έχει δειχθεί in vitro, ότι παρουσία Mg2+ και pH μεγαλύτερου του 7, καταλύουν την διάσπαση του εαυτού τους σε συγκεκριμένη θέση, δημιουργώντας ένα 2'-3' κυκλικό φωσφοδιεστερικό δεσμό προς την 5' πλευρά του σημείου διάσπασης και ένα 5'-ΟΗ προς την 3' πλευρά του σημείου διάσπασης Οι θέσεις όπου συμβαίνει η διάσπαση είναι συγκεκριμένες και σχετίζονται με περιοχές συντηρημένων νουκλεοτιδικών αλληλουχιών και δευτεροταγούς δομής. Για τα sTobRV, ASBV και sLTSV, δείχθηκε ότι ακριβώς αυτές οι συντηρημένες περιοχές απαιτούνται για την διάσπαση και έτσι πιθανόν να εμπλέκονται άμεσα στην αντίδραση. Η κοινή σε όλα τα παραπάνω RNA, δευτεροταγής δομή που σχετίζεται με αυτές τις περιοχές, είναι η ονομαζόμενη "σφυροκέφαλη" δομή, όπως φαίνεται στο (Εικόνα 11 ). Πήρε το όνομά της, λόγω της ομοιότητάς της με το κεφάλι ενός αντίστοιχου τύπου σφυριού, χάριν της οποίας ονομάστηκαν έτσι και τα ριβόζυμα αυτής της υποκατηγορίας. Χαρακτηρίζεται από την παρουσία αρκετών συντηρημένων νουκλεοτιδίων κατάλληλα διατεταγμένων σε τρείς έλικες Ι, ΙΙ και ΙΙΙ και δυο μονόκλωνων περιοχών, η αρίθμηση των οποίων ακολουθεί το διεθνώς καθορισμένο και αποδεκτό σύστημα αρίθμησης των.[1]
Εικόνα 11 (A) δευτεροταγής δομή ενός σφυροκέφαλου ριβοζύμου (αριστερά) και ενός φουρκετοειδή ριβοζύμου (δεξιά). Τα έντονα γράμματα δείχνουν τα δεσμευτικά τμήματα του ριβόζυμου (B) αντιπροσώπευση μιας ελικάσης RNA συνδεμένης σε υβρίδιο με το ριβόζυμο Ένα ριβόζυμο που συνδέεται με μία ελικάση RNA μπορεί να διασπάσει μια κρυμμένη περιοχή στόχο μετά από την τοπική τροποποίηση της δευτεροταγούς δομής του mRNA.[7]
Μερικά μικρά (~350 βάσεις) μολυσματικά RNA φυτών (ιοειδή) μπορούν να καταλύσουν μια αντίδραση αυτοκοπής.(Εικόνα 12) Τα προϊόντα της αντίδρασης είναι δύο τμήματα RNA που το ένα έχει 5΄-ΟΗ άκρο και το άλλο ένα 2΄-3΄-κυκλικό φωσφοδιεστερικό άκρο. Το καταλυτικό κέντρο αποτελείται από 58 νουκλεοτίδια που σχηματίζουν τρεις φουρκέτες-θηλιές των οποίων η θέση και το μέγεθος αλλά όχι η αλληλουχία παραμένουν αμετάβλητες. Στο κέντρο της δομής υπάρχει μια συντηρημένη αλληλουχία 13 νουκλεοτιδίων. Ένα ενεργό ένζυμο μπορεί επίσης να σχηματιστεί από δύο ζευγαρωμένα τμήματα RNA έτσι ώστε το ένα RNA να αντιπροσωπεύει τη μία πλευρά και το άλλο την άλλη πλευρά της δευτεροταγούς δομής. Είναι λοιπόν δυνατό να κατασκευάζουμε in vitro ειδικά μόρια RNA (την ενζυμική αλυσίδα) με αλληλουχία συμπληρωματική προς ένα RNA στόχο (την αλυσίδα υπόστρωμα) με σκοπό την αποκοπή του RNA στόχου από την δράση ριβοζονουκλεάσης. Η αντίδραση ξεκινά με την εξαγωγή ενός πρωτονίου από την 2΄-ΟΗ θέση της κυστιδίνης στόχου προς το μαγνήσιο, με συνέπεια την εξασθένιση του φωσφοδιεστερικού δεσμού και αποκοπή της αλυσίδας RNA στο σημείο αυτό. Ριβόζυμα αυτού του τύπου μπορούν να εκφραστούν ελεγχόμενα σε ένα κύτταρο μετά από μετασχηματισμό του κυττάρου, έτσι ώστε να χρησιμοποιούνται για την καταστροφή ενός συγκεκριμένου RNA στόχου με συνέπεια την απάλειψη της έκφρασης ενός γονιδίου.[8]
Εικόνα 12 (B) Σχήμα από διακλαδισμένος γενωματικό RNA από ένα λανθάνον ιοειδές της μωσαϊκής του ροδάκινου (PLMVd; οικογένεια Avsunviroidae), στο οποίο οι αλληλουχίες είναι συντηρημένες στα περισσότερα φυσικά σφυροκέφαλα ριβόζυμα που φαίνοντα με κόκκινο και μπλέ υπόβαθρο για (+) and (-)πολικότητες, αντίστοιχα, και οι αυτοκοπτώμενες θέσεις είναι υποδειγμένες με βέλη. Οι κόκκινοι κύκλοι δείχνουν μια αλληλεπίδραση κοντινών βρόχων. Η δομή των (+)των σφυροκέφαλων ριβόζυμων παρουσιάζεται στο κουτί που παρεμβάλλεται, με απεικόνιση Roman και Arabic νούμερων έλικες I, II and III, και βρόχοι 1 and 2, αντίστοιχα, και η με βέλη ένδειξη των αυτοκοπτώμενων θέσεων. Πράσινο oval δείχνει μια τριτογενή αλληλεπίδραση μεταξύ των βρόχων 1 και 2 που ενισχύει την καταλυτική δραστηριότητα.[9]
Σύνταξη του RNA
Εκτός από την εκτομή εσωνίων και τις τροποποιήσεις των άκρων ενός πρώιμου μεταγράφου, έχει βρεθεί ότι σε ορισμένες περιπτώσεις ώριμα mRNA περιέχουν βάσεις που δεν βρίσκονται στο γονίδιο από το οποίο μεταγράφηκαν ή αντίθετα λείπουν από το RNA βάσεις που υπάρχουν στο γονίδιο. Οι μετα-μεταγραφικές τροποποιήσεις αυτές καλούνται RNA σύνταξη. Ενα παράδειγμα τέτοιας τροποποίησης του mRNA είναι αυτό του γονιδίου της απολιποπρωτεΐνης-Β στο συκώτι και το έντερο των θηλαστικών. Το μοναδικό γονίδιο κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη 512 kDa στο συκώτι, ενώ στο έντερο βρίσκεται ένα τμήμα της πρωτεΐνης μεγέθους 250 kDa. Η διαφορά προέρχεται από μια μετα-μεταγραφική αλλαγή του πρώιμου μετάγραφου στο έντερο. Μία από-αμινάση μετατρέπει την κυτιδίνη στο κωδικό 2153 σε ουριδίνη. Η μετατροπή αυτή αλλάζει την τριπλέτα βάσεων από CAA σε UAA με συνέπεια τη δημιουργία κωδικού λήξης στη θέση 2153 και σύνθεση μικρότερης πρωτεΐνης.
Ένας διαφορετικός μηχανισμός σύνταξης RNA λειτουργεί στα μιτοχόνδρια τρυπανοσωμάτων. Ορισμένα mRNA φέρουν πολλές επιπρόσθετες ουριδίνες που δεν βρίσκονται στα γονίδια από τα οποία μεταγράφονται. Η σύνταξη του RNA στις περιπτώσεις αυτές γίνεται με τη βοήθεια RNA οδηγών που μεταγράφονται από διαφορετικά γονίδια. Τα RNA οδηγοί φέρουν συμπληρωματικές αλληλουχίες στην περιοχή της σύνταξης του mRNA στόχου και επιπρόσθετες αδενίνες στις θέσεις που θα εισαχθούν οι ουριδίνες στο mRNA στόχο. Άσχετα με το συνολικό αριθμό αλλαγών, μία ουριδίνη εισάγεται κάθε φορά με τομή του RNA στόχου στην περιοχή της εισαγωγής, σύνδεση της ουριδίνης και επανένωση των άκρων. Τις αντιδράσεις αυτές πραγματοποιεί ένα ενζυμικό σύμπλοκο που περιέχει μία ενδονουκλεάση, μία τερματική ουριδυλοτρανσφεράση και μία RNA λιγάση.[8]
Πίνακας 1 Βασικές αντιδράσεις που είναι δυνατόν να καταλυθούν από ριβόζυμα.[10]
Τα ριβόζυμα και η εξέλιξη
Η ανακάλυψη των ριβοζύμων μας οδηγεί σε σημαντικά συμπεράσματα που αφορούν στην εξέλιξη. Μπορούμε να υποθέσουμε ότι τα πρώτα συστήματα με δυνατότητα αναπαραγωγής του εαυτού τους, αποτελούν μόνο από νουκλεϊκά οξέα με απλές καταλυτικές λειτουργίες, αυτές που χρειάζονται για την σύνδεση και αποκοπή φωσφοδιεστερικών δεσμών. Αν υποθέσουμε ότι η συμμετοχή των 2΄-ΟΗ ομάδων στις σημερινές αντιδράσεις εκτομής εσωνίων προέρχεται από τις αρχέγονες εκείνες καταλυτικές λειτουργίες, τότε το αρχικό νουκλεϊκό οξύ ήταν RNA και όχι DNA το οποίο δεν έχει υδροξύλιο στη θέση 2΄.(Εικόνα 13 ) Οι πρώτες πρωτεΐνες ανέλαβαν αρχικά τη σταθεροποίηση της δομής του RNA και σταδιακά λόγω της πολυμορφίας τους ανέλαβαν και την πληθώρα των ενζυμικών αντιδράσεων.[8]
Εικόνα 13 Η υπόθεση ότι το RΝΑ ήταν εξελικτικά προγενέστερο του DΝΑ και των πρωτεϊνών. Στα πιο αρχέγονα κύτταρα, τα μόρια του RΝΑ συνδύαζαν γενετικές, δομικές και καταλυτικές λειτουργίες. Στις μέρες μας, οι γενετικές πληροφορίες αποθηκεύονται στο DΝΑ. ενώ όλες σχεδόν οι καταλυτικές λειτουργίες των κυττάρων επιτελούνται από τις πρωτεΐνες. Το RΝΑ λειτουργεί πλέον σαν ένας μεσάζοντας κατά την πρωτεϊνοσύνθεση και διατηρεί τις καταλυτικές του ιδιότητες για λίγες κρίσιμες αντιδράσεις.[10]
Από τη γνώση που έχουµε σήµερα, το DNA είναι ο φορέας της πληροφορίας, το RNA ο «εντεταλµένος ενδιάµεσος» και οι πρωτεΐνες ο «εκτελεστής των πληροφοριών». Με εξαίρεση το γονιδίωµα κάποιων ιών, που αποτελείται από µονόκλωνο ή δίκλωνο RNA, όλοι οι οργανισµοί έχουν γονιδίωµα µε DNA ως µόριο αποθήκευσης της γενετικής πληροφορίας.
Υπάρχει µεγάλη διαφορά ρόλων µεταξύ ενός µακροµορίου εξειδικευµένου στην απο-θήκευση και διατήρηση της γενετικής πληροφορίας, και ενός µακροµορίου που εµφανίζει καταλυτικές ιδιότητες. Το πρώτο είναι «αδρανές» από πλευράς καταλυτικών ιδιοτήτων, ενώ το δεύτερο είναι «ενεργό». Αυτή η διάκριση ρόλων είναι σαφής µεταξύ DNA και πρωτεϊνών, αλλά και µεταξύ DNA και RNA: το RNA εµφανίζει σηµαντικές καταλυτικές ιδιότητες. Η προηγούµενη παρατήρηση οδηγεί σε έναν φαύλο κύκλο (του τύπου «η κότα κάνει το αβγό ή το αβγό την κότα;»): Συγκεκριµένα, ποιο απ’ τα δύο προηγήθηκε, τα λειτουργικά µακροµόρια ή το µόριο–φορέας της πληροφορίας για τη σύνθεσή τους; Αν προηγήθηκε ο αβιοτικός σχηµατισµός «ενεργών» µακροµορίων, τότε πώς µπόρεσαν να µεταβιβάσουν την πληροφορία για την κατασκευή τους σε ένα άλλου τύπου«αδρανές» αποθηκευτικό µόριο; Από την άλλη πλευρά, αν προηγήθηκε η δηµιουργία ενός µορίου–αποθήκης, πώς «ήξερε» το τι θα αποθηκεύσει και, σε τελευταία ανάλυση, πώς δηµιουργήθηκε χωρίς τη µεσολάβηση λειτουργικών µορίων; Η απάντηση στα πιο πάνω ερωτήµατα φαίνεται τελικά να είναι απλή:
Το πρώτο µόριο αποθήκευσης πληροφοριών θα πρέπει να ήταν ταυτόχρονα και καταλυτικά ενεργό, η δε δραστικότητά του (λειτουργία του) θα αρκούσε να περιοριζόταν απλώς στην αναπαραγωγή του.
Αυτή η πρόταση είναι συµβατή µε το ερώτηµα αναζήτησης του «ελαχίστου» από πλευράς λειτουργίας και κωδικοποίησης στον πρωτοοργανισµό αλλά η εµφάνιση τέτοιων ζωντανών µορίων δεν προϋποθέτει αναγκαστικά «κυτταρική» οργάνωση και εποµένως η παρουσία τους θα µπορούσε να έχει προηγηθεί της εµφάνισης του πρωτοοργανισµού. Ποιο όµως από τα τρία πληροφοριακά µακροµόρια έχει τη δυνατότητα να παίξει το διπλό ρόλο του γενετικού υλικού και του µορίου µε καταλυτικές ιδιότητες. (Εικόνα 14 )Οι πρωτεΐνες αποκλείονται, γιατί ουδέποτε έχει παρατηρηθεί ροή της γενετικής πληροφορίας από πρωτεΐνη σε πρωτεΐνη ή από πρωτεΐνη σε νουκλεϊκά οξέα (η µετάφραση του mRNA σε πρωτεΐνη αποτελεί µονόδροµο στη ροή της γενετικής πληροφορίας).Επίσης, αποκλείεται το DNA, γιατί δεν υπάρχουν ενδείξεις εµφάνισης καταλυτικών ιδιοτήτων, συγκρίσιµων τουλάχιστον µε αυτές του µονόκλωνου RNA. (Αυτό είναι αποτέλεσµα της δίκλωνης δοµής του DNA, που «εξουδετερώνει» την ανάπτυξη πιθανής λειτουργικότητας λόγω δέσµευσης πρωτονίων –σχηµατισµός υδρογονικών δεσµών–µε ταυτόχρονη ελάττωση του ∆G, όπως και µε την «αδρανοποίηση» της 2΄ υδροξυλοµάδας της ριβόζης. Τα χαρακτηριστικά αυτά προσφέρουν στο DNA χηµική σταθερότητα, σηµαντική ιδιότητα για µόριο–αποθήκη της γενετικής πληροφορίας, αλλά το καθιστούν «ανενεργό» σε σχέση µε µονόκλωνα µόρια RNA.). Έτσι, παρά τη γενικευµένη παρουσία του DNA στους σηµερινούς οργανισµούς, το πρώτο γενετικό υλικό θα πρέπει να ήταν το RNA. Η πατρότητα αυτής της υπόθεσης αποδίδεται στον S.Spiegelman, ενώ λίγο αργότερα πήρε δια-στάσεις εξελικτικής θεωρίας, όπως διατυπώθηκε από τον M. Eigenτο 1971.
Το RΝΑ δεν προκύπτει ως το προϊόν ενός σχεδόν θαυμαστού γεγονότος. Σχηματίζεται από χημεία, όπως απαιτείται. Αλλά γίνεται κυρίαρχο χάρη σε μια νέα διαδικασία, τη μοριακή επιλογή, η οποία, η ίδια, βασίζεται στην αντιγραψιμότητα. Αυτό ήταν μια αποφασιστική καμπή στην ανάπτυξη της ζωής. Έως τότε, η χημεία είχε την αποκλειστική ευθύνη. Για να είμαστε σίγουροι, η συνοχή εξασφαλιζόταν από την αυστηρή αιτιοκρατία στην οποία υπόκειται η χημεία· για τον ίδιο λόγο όμως, είχε εκτεθεί και στις ιδιοτροπίες του περιβάλλοντος. Με την έλευση της αντιγραφής, η πιστή αναπαραγωγή μορίων έγινε πλέον δυνατή ακόμη και κάτω από μεταβαλλόμενες συνθήκες του περιβάλλοντος. Ο πρώτος σπόρος της γενετικής συνοχής φυτεύτηκε.
Οι αρχέγονες αντιγραφές ήταν αναμφίβολα πολύ ανακριβείς, παράγοντας διαρκώς ατελή αντίγραφα των προτύπων. Μεταξύ αυτών των ελαττωματικών αντιγράφων, πρέπει να υπήρξαν κάποια που, για διάφορους λόγους, ήταν ανθεκτικότερα στη διάσπαση από τα πρωτότυπα, ή που αντιγράφονταν γρηγορότερα από αυτά από τον καταλύτη που ευθυνόταν για τη σύνθεση των πρώτων RΝΑ. Και στις δύο περιπτώσεις, τα εν λόγω μόρια έτειναν να γίνουν αφθονότερα από άλλα. Ως συνέπεια, το αρχικό μίγμα RΝΑ που προέκυπτε από τα πρώτα προϊόντα προβιωτικής χημείας προοδευτικά υπόκειντο στην κυριαρχία μορίων RΝΑ που συνδύαζαν σταθερότητα και ικανότητα αντιγραφής με το βέλτιστο τρόπο.
Αυτό δεν είναι απλώς ένα θεωρητικό όραμα. Η μοριακή επιλογή του RΝΑ μπορεί πραγματικά να αναπαραχθεί στο εργαστήριο. Αυτός ο άθλος επιτεύχθηκε για πρώτη φορά τη δεκαετία του 1960 από έναν Αμερικανό βιοχημικό, τον Sol Spiegelman, και έχει από τότε επαναληφθεί κάτω από διάφορες συνθήκες από πολλούς ερευνητές, μεταξύ των οποίων ο Γερμανός χημικός Manfred Eigen, ο οποίος έχει διεξαγάγει μια ιδιαίτερα λεπτομερή μελέτη του φαινομένου. Αυτές οι έρευνες έχουν ξεκάθαρα καθορίσει ότι ο εμπλεκόμενος μηχανισμός όντως συνίσταται από μια μοριακή επιλογή που διέπεται εξ ολοκλήρου από το συνδυασμένο κριτήριο της σταθερότητας-αντιγραψιμότητας των μορίων.
Αυτός ο μηχανισμός, πρέπει να τονισθεί, αντιπροσωπεύει στο μοριακό επίπεδο αυτό ακριβώς που φαντάσθηκε ο Darwin ότι θα μπορούσε να ερμηνεύσει τη βιολογική εξέλιξη: την παραγωγή ποικιλίας μέσα από τροποποιήσεις του υλικού που ευθύνεται για την κληρονομική συνέχεια, τη φυσική επιλογή των τροποποιημένων μορφών με μεγαλύτερη τάση να επιβιώσουν και να πολλαπλασιασθούν κάτω από τις επικρατούσες συνθήκες, και την ενίσχυση αυτών των μορφών. Αλλά τα μόρια, όχι οι οργανισμοί, επιλέγονται κατ' αυτό τον τρόπο, με το RΝΑ να είναι ο πρώτος καρπός αυτού του θεμελιώδους μηχανισμού.
Η μοριακή επιλογή του RΝΑ που συνέβη κάτω από τις συνθήκες της προβιωτικής εποχής πρέπει να οδήγησε τελικά σε μια κυρίαρχη αλληλουχία που εφεξής παρέμεινε αμετάβλητη - αυτή που συνδύαζε σταθερότητα και αντιγραψιμότητα με το βέλτιστο τρόπο για εκείνες τις συνθήκες - και συνοδευόταν από μια διαρκώς μεταβαλλόμενη ομάδα αλληλουχιών που τροποποιούνταν μέσω ατυχημάτων αντιγραφής. Ο Eigen ονόμασε αυτό το μίγμα ένα «οιονεί-είδος» Έφθασε, με έρευνες στο συμπέρασμα ότι το κυρίαρχο μόριο του οινοεί-είδους που διαμορφώθηκε από τα πρώτα RΝΑ, το «UrGen», ή αρχικό γονίδιο, αντιστοιχούσε πιθανώς στον πρόγονο, όπως προσδιορίζεται από μοριακές αναλύσεις φυλογένεσης, ολόκληρης της οικογένειας μεταφορικών RΝΑ.
Το υποθετικό σενάριο που μόλις σκιαγραφήθηκε - ή οποιοδήποτε άλλο υπακούει στα ίδια κριτήρια - καταδεικνύει πώς η αρχική ζωή θα μπορούσε να είχε εισέλθει σε μια φάση που δικαιολογημένα θα μπορούσε να αποκαλείται «κόσμος του RΝΑ», αν και όχι - τουλάχιστον, όχι ακόμη - ένας κόσμος RΝΑ υποστηριζόμενος από καταλύτες RΝΑ, όπως πρότεινε ο Gilbert, το οποίο δεν θα μπορούσε προφανώς να συμβαίνει κατά τη γέννηση του. Το RΝΑ δεν θα μπορούσε να έχει χρησιμεύσει αρχικά για να φτιάξει RΝΑ. Το αν ποτέ το έκανε, δεν μπορεί να αποκλεισθεί, αλλά μια τέτοια θέση είναι έως τώρα τελείως αστήρικτη από τα στοιχεία. Αυτό που φαίνεται ιδιαίτερα πιθανό, από την άλλη πλευρά, είναι ότι το RΝΑ χρησίμευσε για να δημιουργήσει πρωτεΐνες.[11]
Εικόνα 14 Ένα μόριο RNA ικανό να καταλύει τη σύνθεσή του. Αυτή η υποθετική διεργασία θα προϋπόθετε την κατάλυση και των 2 βημάτων που παρουσιάζονται στην εικόνα.Οι κόκκινες ακτίνες αντιπροσωπεύουν το ενεργό κέντρο του RNA ενζύμου.[10]
Το στάδιο αυτό οριοθετείται από την πρώτη εµφάνιση του φαινοµένου της κωδικο-ποίησης µέχρι του χρονικού σηµείου της συγκρότησης του πρωτοοργανισµού. Ο σχη-µατισµός λειτουργικών υπερµοριακών συµπλεγµάτων όπως και η ανάπτυξη αφοριστικών µέσων προστασίας αποτελούν γεγονότα που εξελίχθηκαν παράλληλα και σε συνάρτηση µε τη διαδικασία εµφάνισης του πρώτου γενετικού υλικού.
Συνοπτικά, οι λόγοι που δικαιολογούν την παραδοχή ότι το RNA, και όχι το DNA, αποτέλεσε το πρώτο γενετικό υλικό είναι οι εξής:
1.Η αβιοτική σύνθεση της δεοξυριβόζης είναι εξαιρετικά δύσκολη σε αντίθεση µε την εύκολη σύνθεση ριβόζης.
2.Σε όλα τα σηµερινά κύτταρα δεν συντίθεται απευθείας δεοξυριβόζη, αλλά παρά-γεται µε αναγωγή του 2΄–ΟΗ «έτοιµων» διφωσφορικών ριβονουκλεοζιδίων, µε τη µεσολάβηση ενός ειδικού ενζύµου (διφωσφορο–ριβονουκλεοζιδική αναγωγάση).
3.Η παρουσία του 2΄–ΟΗ σε ορισµένα σύγχρονα µόρια RNA τους προσδίδει ιδιότητες που θα περιµέναµε από (πρωτεϊνικά) ένζυµα. Αυτά τα RNA είναι γνωστά ως ριβόζυµα. Πρωτοπόροι στη µελέτη της δράσης των ριβοζύµων υπήρξαν οι Thomas R. Cechκαι Sidney Altman,οι οποίοι έδωσαν παραδείγµατα µηχανισµών κατάλυσης και αυτοκατάλυσης (δράση στον εαυτό τους) RNA µορίων Για τις ανακαλύψεις τους αυτές έλαβαν από κοινού βραβείο Nobel το 1989. Η δυνατότητα αυτοκατάλυσης είναι σηµαντική προϋπόθεση για να δεχτούµε το διπλό ρόλο του πρώτου ζωντανού µορίου και συγκεκριµένα τη δυνατότητα αναπαραγωγής του. Αυτό όµως το θέµα συζητείται εκτενέστερα στη συνέχεια.
4.Τέλος, το 2΄–ΟΗ εµπλέκεται σε µη τυπικούς υδρογονικούς δεσµούς, µε αποτέλεσµα τη δυνατότητα σχηµατισµού ποικίλων στερεοδοµών και ως εκ τούτου την ανάπτυξη επιπρόσθετων και εξειδικευµένων λειτουργιών (τυπικό παράδειγµα είναι τα tRNA). Η στερεοδοµή και όχι αυτή καθαυτή η αλληλουχία των αµινοξέων (πρωτεΐνες) ή των νουκλεοτιδίων (νουκλεϊκά οξέα) είναι η ικανή και αναγκαία συνθήκη για την εµφάνιση ενεργότητας. Πολλά από τα σύγχρονα λειτουργικά RNA ονοµάζονται και «ζωντανά απολιθώµατα», µε την έννοια ότι διαθέτουν ιδιότητες, αποµεινάρια του κόσµου του RNA, που προηγήθηκε του κόσµου του DNA.
Μόρια RNA που εµπεριέχουν την πληροφορία για την αντιγραφή τους είναι γνωστά µε τη γενική ονοµασία «ρεπλικάσες» (replicases), ονοµασία που επιτρέπει τη διάκρισή τους από τα σύγχρονα ένζυµα αντιγραφής του DNA (πολυµεράσες,polymerases). Η αναζήτηση του µηχανισµού δράσης µιας αρχέγονης ρεπλικάσης βασίζεται τόσοσε παραδείγµατα γνωστών ριβοενζύµων όσο και σε in vitro πειραµατικές διατάξεις. Μια από τις καλύτερα τεκµηριωµένες υποθέσεις για τη δράση της υποθετικής ρεπλικάσης έχει περιγραφεί από τον Cech. Η εργασία του βασίζεται στον τρόπο αποβολής του εσωνίου από το pre–rRNA της Tetrahymena, αλλά το πλέον σηµαντικό σηµείο της πρότασής του αφορά τη δυνατότητα in vitro τροποποίησης του αρχικού µορίου RNA, η οποία το καθιστά ικανό όχι µόνο για την αντιγραφή του εαυτού του αλλά και άλλων µορίων RNA. Μάλιστα, το 1997, σε δηµοσίευσή του στο περιοδικό Nature(390:96) µαζί µε τον B. Zhang, αποδεικνύει τη δυνατότητα συµµετοχής ριβοενζύµων και σε κατάλυση πεπτιδικών δεσµών.Προς την κατεύθυνση των συµπερασµάτων του Cech, αλλά και προς την κατεύθυνση επιβεβαίωσης της αρχικής υπόθεσης των Spiegelman και Eigen, συγκλίνουν και οι απόψεις άλλων επιστηµόνων, µεταξύ των οποίων βρίσκονται ονόµατα σπουδαίων ερευνητών, όπως οι Biebricher, Chyba κ.ά. Αν και τα ριβόζυµα έχουν ηλικία περίπου 15 ετών, τη διετία 1995–97 συσσωρεύτηκαν τόσες πειραµατικές αποδείξεις για τη δράση τους ως ρεπλικάσες, ώστε σε συνδυασµό µε την τεχνολογία του ανασυνδυασµένου DNA έχουν ήδη αρχίσει πειράµατα εφαρµογής για θεραπευτικούς σκοπούς, όπως και για τη µελέτη παραγόντων που ρυθµίζουν τη γονιδιακή έκφραση[12]
Η υπόθεση του κόσμου του RNA απαιτεί ένα ριβόζυμο που ήταν μια RNA-κατευθυνόμενη RNA πολυμεράση (ribopolymerase). Εάν μια τέτοια ρεπλικάση κάνει ένα αντίστροφο συμπληρωματικό αντίγραφο οποιασδήποτε ακολουθίας (συμπεριλαμβανομένου του εαυτού του), σε έναν απλό κόσμο RNA, δεν υπάρχει κανένας μηχανισμός για να αποτρέψει την αυτο-υβριδοποίηση. Προτείνεται ότι αυτό μπορεί να αποφευχθεί μέσω της σύνθεσης ενός παράλληλου συμπληρωματικού αντιγράφου. Οι λογικές συνέπειες αυτού ακολουθούνται και αναπτύσσονται με μια προσομοίωση σε υπολογιστές, όπου η συμπεριφορά του παράλληλου αντιγράφου συγκρίνεται με το συμβατικό αντίστροφο συμπληρωματικό αντίγραφο. Διαπιστώνεται ότι το παράλληλο αντίγραφο είναι αποδοτικότερο στις υψηλότερες θερμοκρασίες (μέχρι
Η υπόθεση σχετικά µε το ότι ο Κόσµος του RNA υπήρξε το πρώτο βήµα για την εµφάνιση της ζωής στον πλανήτη µας επιλύει τόσα προβλήµατα, έτσι ώστε σήµερα έχει παγιωθεί η εντύπωση ότι κάπως έτσι «ξεκίνησαν τα πράγµατα». Όµως εξακολουθούν να υπάρχουν ερωτήµατα, µερικά από τα οποία δεν φαίνεται να είναι θέµα χρόνου για να απαντηθούν. Για παράδειγµα, το ότι δεν έχει µέχρι σήµερα συντεθεί προβιοτικά στο εργαστήριο ένα µόριο µε ιδιότητες αυτο–αντιγραφής µπορεί να θεωρηθεί ότι είναι θέµα χρόνου. ∆εν είναι όµως θέµα χρόνου η απάντηση στα εξής δύο ερωτήµατα: (α) Αν η δυσκολία προβιοτικής σύνθεσης δεοξυριβόζης είναι ένας από τους λόγους που µας οδηγούν στην παραδοχή ότι το RNA ήταν το πρώτο ζωντανό µόριο, τότε πώς δικαιολογείται η παρουσία πουρινών και πυριµιδινών, δεδοµένου ότι, σε αντίθεση µε τις πουρίνες, οι πυριµιδίνες συντίθενται προβιοτικά σχεδόν το ίδιο δύσκολα όπως η δεοξυριβόζη; (β) Πώς µπόρεσε να έχει αποτελεσµατική δράση η υποθετική ρεπλικάση, αφού ήταν υποχρεωµένη να χρησιµοποιεί προδρόµους από το περιβάλλον, οι οποίοι µε προβιοτική σύνθεση θα αποτελούσαν µίγµα D– και L–µορφών; Με πειραµατικές προσεγγίσεις (του G. F. Joyce και των συνεργατών του)έχει αποδειχθεί ότι η αντιγραφή µορίων RNA, κάτω από προβιοτικές συνθήκες, ανακόπτεται αµέσως παρουσία µίγµατος προδρόµων D– και L– µορφής. Για τα ερωτήµατα αυτά δεν έχει δοθεί µέχρι σήµερα καµιά πειστική απάντηση, αλλά η εµβέλειά τους δεν καταρρίπτει την όλη υπόθεση για την πρώτη εµφάνιση ζωντανών µορίων. Μάλλον υποδηλώνει τη δική µας αδυναµία για κατανόηση κάποιων φυσικών φαινο-µένων και, εποµένως, δεν αποκλείεται να αποδειχθεί στο µέλλον ότι οι απαντήσεις και γι’ αυτά τα ερωτήµατα ήταν τελικά θέµα χρόνου.[12]
Ανακαλύφθηκε ότι ορισμένα RNA που συναντώνται στη φύση κατέχουν στο μόριό τους μια συγκεκριμένη νουκλεοτιδική ακολουθία, στην οποία οφείλεται η ικανότητά τους να καταλύουν την διάσπαση του εαυτού τους σε συγκεκριμένη θέση. Από τα πειράματα των Haseloff και Gerlach (1988) και Tabler και Tsagris (1991), δείχθηκε ότι σε οποιοδήποτε μόριο RNA είναι δυνατόν να τοποθετηθεί σε συγκεκριμένη θέση του η παραπάνω νουκλεοτιδική περιοχή, που θα του προσδίδει καταλυτικές ιδιότητες, έτσι ώστε να δύναται να διασπά in trans το κατάλληλο συμπληρωματικό RNA στόχο του. Οι εργασίες αυτές, στις οποίες ουσιαστικά ξεπεράστηκαν κατασκευαστικά προβλήματα των ριβοζύμων, αποτέλεσαν και το έναυσμα για μια πληθώρα in vitro και in vivo μελετών, οι οποίες αναφέρονται αναλυτικότερα στην "Εισαγωγή", όπου το ριβόζυμο και το υπόστρωμα-RNA συνυπήρχαν ή συνεκφράζονταν, τόσο σε προκαρυωτικά όσο και ευκαρυωτικά ζωικά και φυτικά κύτταρα. Από τις δημοσιεύσεις αυτές επιβεβαιώνεται η άποψη, ότι η ύπαρξη της καταλυτικής περιοχής στο αντίστοιχο RNA αποτελεί μια σημαντική βελτίωση της τεχνολογίας των αντικωδικών RNA για την αναστολή της γονιδιακής έκφρασης, αφού ο σχηματισμός του δίκλωνου συμπλόκου μεταξύ του RNA στόχου και του αντικωδικού RNA είναι θεωρητικά αντιστρέψιμος, ενώ στην περίπτωση των ριβοζύμων, λόγω ακριβώς των ενδονουκλεολυτικών ιδιοτήτων τους το υπόστρωμα RNA επηρεάζεται κατά τρόπο μη αντιστρέψιμο.[14]
Με την ανάπτυξη της τεχνολογίας των ριβοζύμων, δηλαδή των μορίων εκείνων του RNA, που έχουν την ικανότητα να διασπούν κάποιο άλλο συγκεκριμένο μόριο RNA, εμπλουτίστηκε το οπλοστάσιό μας, στην προσπάθεια να ρυθμίσουμε την γονιδιακή έκφραση ανακαλύπτοντας έτσι μέρος της αλήθειας ή θεραπεύοντας σημαντικές ασθένειες-μάστιγες της εποχής μας, ενώ η πραγματοποίηση αρκετών από τα όσα προτείνονται παραπάνω, πιστεύεται ότι θα συμβάλλει αισθητά στην καλυτέρευση της απόδοσής τους για τον σκοπό αυτό.[15]
Ü Στοιχεία εκπαιδευτικού:
Ονοματεπώνυμο: Μπακολίτσας Κωνσταντίνος
Βαθμίδα εκπαίδευσης: Δευτεροβάθμια Εκπαίδευση
Ειδικότητα: Βιολόγος ΠΕ04(04)
Μαθήματα που διδάσκει : Βιολογία.-Φυσική-Χημεία.
Ü Τίτλος μαθήματος: «Τι είναι τα ριβόζυμα και ποια είναι η σημασία τους στην επιστήμη της εξέλιξης »
Ü Γνωστικό αντικείμενο (Σχέση με το Πρόγραμμα Σπουδών): Βιολογία Γενικής Παιδείας Β΄ Λυκείου, Βιολογία Κατεύθυνσης Γ΄ Λυκείου.
Ü Τάξη: Β΄ Λυκείου, Γ΄ Λυκείου
Ü Διδακτική ενότητα: 1ο Κεφάλαιο, 2ο Κεφάλαιο (αντίστοιχα)
Ü Προβλεπόμενος χρόνος: 2 διδακτικές ώρες. Αυξομειώσεις κατά το δοκούν.
Σκοποί διδασκαλίας
Ο μαθητές θα πρέπει να :
ü Να γνωρίζουν και να διακρίνουν τα νουκλεϊκά οξέα σε DNA και RNA.
ü Να γνωρίζουν το ρόλο του καθενός και τη σημασία τους στις σύγχρονες μορφές ζωής, το ότι το DNA είναι ο φορέας της πληροφορίας, το RNA ο «εντεταλµένος ενδιάµεσος» και οι πρωτεΐνες ο «εκτελεστής των πληροφοριών». Με εξαίρεση το γονιδίωµα κάποιων ιών, που αποτελείται από µονόκλωνο ή δίκλωνο RNA, όλοι οι οργανισµοί έχουν γονιδίωµα µε DNA ως µόριο αποθήκευσης της γενετικής πληροφορίας. Στη συνέχεια να γνωρίσουν το ρόλο που πιθανώς να διαδραμάτισε κάθε ένα από αυτά από την εμφάνιση της ζωής στον πλανήτη μας μέχρι και σήμερα.
ü Να ξέρουν ότι υπάρχουν RNA με καταλυτικές και αυτό-καταλυτικές ιδιότητες, που ονομάζονται ριβόζυμα.
ü Να γνωρίζουν ότι η ανακάλυψη των ριβοζύμων μας οδηγεί σε σημαντικά συμπεράσματα που αφορούν στην εξέλιξη
ü Να διερευνήσουν το αν το RΝΑ ήταν εξελικτικά προγενέστερο του DΝΑ και των πρωτεϊνών.
ü Γνωρίζουν ότι το πρώτο µόριο αποθήκευσης πληροφοριών θα πρέπει να ήταν ταυτόχρονα και καταλυτικά ενεργό, η δε δραστικότητά του (λειτουργία του) θα αρκούσε να περιοριζόταν απλώς στην αναπαραγωγή του.
ü Αναζητήσουν τους λόγους που δικαιολογούν την παραδοχή ότι το RNA, και όχι το DNA, αποτέλεσε το πρώτο γενετικό υλικό.
ü Γνωρίζουν ότι πολλά από τα σύγχρονα λειτουργικά RNA ονοµάζονται και «ζωντανά απολιθώµατα», µε την έννοια ότι διαθέτουν ιδιότητες, αποµεινάρια του κόσµου του RNA, που προηγήθηκε του κόσµου του DNA.
ü Διερευνήσουν για τον αντίλογο στην παραδοχή αυτή.
ü Γνωρίζουν το γιατί το DNA τελικά έχει επιλεγεί σαν το κυρίως πληροφοριακό μόριο, το ότι αυτό είναι αποτέλεσµα της δίκλωνης δοµής του DNA, που «εξουδετερώνει» την ανάπτυξη πιθανής λειτουργικότητας λόγω δέσµευσης πρωτονίων –σχηµατισµός υδρογονικών δεσµών–µε ταυτόχρονη ελάττωση του ∆G, όπως και µε την «αδρανοποίηση» της 2΄ υδροξυλοµάδας της ριβόζης. Να γνωρίζουν επίσης ότι τα χαρακτηριστικά αυτά προσφέρουν στο DNA χηµική σταθερότητα, σηµαντική ιδιότητα για µόριο–αποθήκη της γενετικής πληροφορίας, αλλά το καθιστούν «ανενεργό» σε σχέση µε µονόκλωνα µόρια RNA.).
ü Χρησιμοποιούν γνώσεις και δεξιότητες που απέκτησαν για την επεξεργασία και την αξιολόγηση δεδομένων ή την επίλυση προβλημάτων.
ü Συλλέγουν πληροφορίες από επιστημονικές πηγές πληροφοριών ή πλήρεις μελέτες τεκμηρίωσης και να χρησιμοποιούν την τεχνολογία της Πληροφορικής, όπου αυτή μπορεί να εξυπηρετήσει τις ανάγκες της εργασίας του.
ü Μελετούν μόνοι ή σε συνεργασία με τους συμμαθητές, τον εκπαιδευτικό αλλά και άλλους φορείς του τοπικού κοινωνικού περιβάλλοντος, θέματα που αφορούν το σχολικό ή το ευρύτερο κοινωνικό περιβάλλον.
ü Αξιολογούν τη δράση του στις διάφορες εκπαιδευτικές δραστηριότητες, συνεκτιμώντας τους παράγοντες επιτυχίας και αποτυχίας. [16]
Διδακτικοί στόχοι
· Γνωστικοί
· Ψυχοκινητικοί
· Συναισθηματικοί
Ειδικοί στόχοι
5) Οι μαθητές ασκούνται στην έρευνα και την αξιολόγηση των πηγών του διαδικτύου (internet).
6) Ασκούνται στην επιλογή πληροφοριών από το διαδίκτυο.
7) Εξοικειώνονται με τις μηχανές αναζήτησης. Μαθαίνουν να αναζητούν ένα βιβλίο σε μια ηλεκτρονική βιβλιοθήκη, ένα ηλεκτρονικό βιβλίο σε ένα ηλεκτρονικό βιβλιοπωλείο, και μαθαίνουν να θέτουν κριτήρια κατά την αναζήτηση.
8) Εξοικειώνονται με τη χρήση του επεξεργαστή κειμένου, του λογισμικού παρουσιάσεων κλπ.
Παιδαγωγικοί στόχοι
Παιδαγωγικές αρχές και μέθοδοι: Η διδασκαλία στηρίζεται στην ενθάρρυνση από τον εκπαιδευτικό της ενεργητικής συμμετοχής και της εμπλοκής των μαθητών στη μαθησιακή διαδικασία (συμμετοχή σε συζήτηση, σε συνεργατικές πρακτικές δραστηριότητες).
Μεθοδολογικές προσεγγίσεις της διδασκαλίας
· Χρήση τεχνικών που ενισχύουν την ενεργητική συμμετοχή.
Εισήγηση μικρής διάρκειας που έχει φωτοτυπηθεί και έχει διανεμηθεί σε όλους τους μαθητές. Για παράδειγμα μπορούμε να ξεκινήσουμε την εισήγηση με τη διαπίστωση ότι υπάρχει µεγάλη διαφορά ρόλων µεταξύ ενός µακροµορίου εξειδικευµένου στην αποθήκευση και διατήρηση της γενετικής πληροφορίας, και ενός µακροµορίου που εµφανίζει καταλυτικές ιδιότητες. Το πρώτο είναι «αδρανές» από πλευράς καταλυτικών ιδιοτήτων, ενώ το δεύτερο είναι «ενεργό». Αυτή η διάκριση ρόλων είναι σαφής µεταξύ DNA και πρωτεϊνών, αλλά και µεταξύ DNA και RNA: το RNA εµφανίζει σηµαντικές καταλυτικές ιδιότητες. Θα πρέπει να τονίσουμε το ότι η προηγούµενη παρατήρηση οδηγεί σε έναν φαύλο κύκλο (του τύπου «η κότα κάνει το αβγό ή το αβγό την κότα;»): Συγκεκριµένα, θα θέσουμε το ερώτημα ποιο απ’ τα δύο προηγήθηκε, τα λειτουργικά µακροµόρια ή το µόριο–φορέας της πληροφορίας για τη σύνθεσή τους; Αν προηγήθηκε ο αβιοτικός σχηµατισµός «ενεργών» µακροµορίων, τότε πώς µπόρεσαν να µεταβιβάσουν την πληροφορία για την κατασκευή τους σε ένα άλλου τύπου«αδρανές» αποθηκευτικό µόριο; Από την άλλη πλευρά, αν προηγήθηκε η δηµιουργία ενός µορίου–αποθήκης, πώς «ήξερε» το τι θα αποθηκεύσει και, σε τελευταία ανάλυση, πώς δηµιουργήθηκε χωρίς τη µεσολάβηση λειτουργικών µορίων; Σ’ αυτά τα ερωτήματα θα εστιάσουμε την αναζήτηση των μάθητών.
· Εύστοχες ερωτήσεις που βοηθούν να διευκρινιστούν οι κύριες έννοιες που εστιάζουν τη σκέψη των μαθητών. Έλεγχος για προηγούμενες γνώσεις, εμπειρίες και βιώματα των μαθητών και με χρήση ερωτηματολογίου που τους δίδεται πριν την έναρξη του μαθήματος .
· Συζήτηση - διάλογος με τους μαθητές σχετικά με τις απαντήσεις που έδωσαν. Κλίμα αμοιβαίας επικοινωνίας φιλικό ευχάριστο και ευγενικό.
· Καταιγισμός ιδεών π.χ. στην έννοια ωρίμανση.
· Επίδειξη - παρουσίαση διαφανειών που θα έχουν σχεδιαστεί με τις δομές και την ενζυμική δράση κάθε κατηγορίας ριβοζύμων ή προβολή βίντεο που θα έχει επιλεγεί για το μάθημα αυτό, και αφορά την ιστορία της εμφάνισης της ζωής στον πλανήτη, τις θεωρίες που έχουν διατυπωθεί από διάφορους επιστήμονες κλπ.
· Ενδιάμεσες ανακεφαλαιώσεις για να επισημάνουμε τα πλέον ουσιώδη σημεία από όσα θα θίξουμε, για να ελέγξουν οι μαθητές αν αυτά που κατάλαβαν είναι και τα σωστά, για να διορθώσουν τυχόν δικές τους παρερμηνείες ή παρανοήσεις, για να προχωρήσουν με σιγουριά στο επόμενο βήμα, εφοδιασμένοι με ορθές και επιβεβαιωμένες γνώσεις.[17]
· Ομάδες εργασίας:
o Συγκρότηση ομάδων (προτείνεται οι μαθητές να χωριστούν σε ομάδες με βάση τη δική τους προτίμηση. Ο καθηγητής φροντίζει με διακριτικότητα να υπάρχει σε κάθε ομάδα ένας μαθητής που χειρίζεται με άνεση τον υπολογιστή) και επιλογή ενός θέματος από κάθε ομάδα π.χ. ποιες είναι οι βασικές αντιδράσεις που είναι δυνατόν να καταλυθούν από ριβόζυμα.
o Καθορισμός στόχων και επιμερισμός εργασίας στα μέλη της κάθε ομάδας.
o Καθορισμός πηγών πληροφόρησης (θα δοθεί λίστα διευθύνσεων στο internet , μηχανών αναζήτησης κ.λ.π. ) και συλλογή στοιχείων.
o Θα γίνεται επιμέρους αξιολόγηση της πορείας της εργασίας (και αν υπάρξει ανάγκη , θα γίνει επαναπροσδιορισμός των στόχων)
o Ταξινόμηση, αξιολόγηση και σύνθεση δεδομένων.
o Παρουσίαση της εργασίας από έναν μαθητή κάθε ομάδας και τελική αξιολόγηση στην τάξη. [18]
o Προσομοίωση με χρήση λογισμικού όπως το αλληλεπιδραστικό εκπαιδευτικό λογισμικό ‘Life 5.0, το Interactive Study Partner, και το Modelus.
Περιγραφή του Λογισμικού Modelus
Το λογισμικό Modellus, το οποίο σχεδιάστηκε από μία ομάδα επιστημόνων με την καθοδήγηση του καθηγητή Vitor Duarte Teodoro από το Πανεπιστήμιο Lisbon της Πορτογαλίας, είναι ένα ισχυρό εργαλείο, ιδιαίτερα χρήσιμο για τη διδασκαλία των θετικών επιστημών. Kυρίως μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την υποστήριξη των Μαθηματικών, της Φυσικής, της Χημείας, των Οικονομικών και της Βιολογίας.
Ανήκει στην κατηγορία του ανοικτού τύπου περιβάλλοντος-εργαλείο για modeling, πειραματισμό και simulation, απαραίτητο για την ανάπτυξη μαθηματικών μοντέλων και την επεξεργασία τους μέσα από γραφικές παραστάσεις , πίνακες και animations.
Στον πυρήνα του προγράμματος υπάρχει μια περιοχή εργασίας (παράθυρο) στην οποία ο μαθητής μπορεί να γράψει το μαθηματικό μοντέλο με μορφή εξισώσεων ή ορισμών μεγεθών. Στη συνέχεια, το σύστημα αναλαμβάνει να πραγματοποιήσει την αναπαράσταση της εξέλιξης του φαινομένου που υπακούει στο μαθηματικό μοντέλο.
To Modellus αξιοποιεί πολλές προηγούμενες προσπάθειες που έγιναν στην κατεύθυνση της δημιουργίας ενός λογισμικού κατάλληλου για μοντελοποιήσεις σε ποικίλες γνωστικές περιοχές.
Παιδαγωγική Προσέγγιση
Είναι ένα λογισμικό πολύ εύκολο στην εκμάθηση και τη χρήση του και άμεσα προσαρμόσιμο στις ανάγκες της Δευτεροβάθμιας εκπαίδευσης. Χρησιμοποιείται από καθηγητές διαφόρων ειδικοτήτων όπως μαθηματικούς, φυσικούς, χημικούς ακόμα και από βιολόγους, οι οποίοι μπορούν να επινοούν σενάρια για διαφορετικά μαθήματα αξιοποιώντας τα διαθέσιμα εργαλεία του λογισμικού. Συνιστάται για μαθήματα της Γ΄ Γυμνασίου καθώς και για όλες τις τάξεις του Λυκείου.
Μέσα από ήδη σχεδιασμένα πειράματα από τον κατάλογο των έτοιμων μοντέλων που συνοδεύουν το λογισμικό ή ακόμα και με τον σχεδιασμό νέων μοντέλων δίνεται στους μαθητές η δυνατότητα να περιγράφουν, να ερμηνεύουν ακόμα και να προβλέπουν διάφορα φαινόμενα, να ασκούνται στη διαδικασία της μοντελοποίησης διαφόρων φαινομένων ή καταστάσεων και να καλλιεργούν νοητικές ικανότητες για την αντιμετώπιση προβλημάτων.
Από παιδαγωγική σκοπιά το Modellus προσφέρει πολλές δυνατότητες διερευνητικής μάθησης. Μέσα από πολλαπλές αναπαραστάσεις (προσομοιώσεις, πίνακες τιμών, αρχικές συνθήκες, αποθηκεύσεις ειδικών καταστάσεων και ανάκλησή τους), τον άμεσο χειρισμό των αντικειμένων, τη δυνατότητα σκηνοθεσίας του περιβάλλοντος και τις μοντελοποιήσεις οι μαθητές μπορούν να κατανοούν καινούργιες έννοιες και διαδικασίες μέσα από την επίλυση προβλημάτων και τον πειραματισμό. [19]
Ρόλοι και ενέργειες του καθηγητή.
Ο καθηγητής έχει το ρόλο του διευκολυντή της υλοποίησης του σχεδίου. Παρακολουθεί διακριτικά τις εργασίες των ομάδων και συζητά με τις ομάδες των μαθητών, χωρίς να προκαταλαμβάνει ή να κατευθύνει άμεσα τις ενέργειές τους.
Μέσα και υλικό
Εξοπλισμός: Υπολογιστές με σύνδεση στο Διαδίκτυο, βιντεοπροβολέας, οθόνη προβολής, πακέτα κατασκευής χημικών μοντέλων, κλπ.
Λογισμικό:
· Office 2003, Windows XP, Wbs
· Αλληλεπιδραστικό εκπαιδευτικό λογισμικό:
o ‘Life 5.0 .[20],
o Interactive Study Partner.[21]
o Modelus
Αξιολόγηση
Μπορεί να είναι συντρέχουσα και τελική. Συντρέχουσα θα γίνεται κατά τη διάρκεια του μαθήματος με τον καθηγητή να παρατηρεί πως εργάζονται οι ομάδες.Στό τέλος θα εξακριβώσει με γραπτό ή προφορικό τρόπο πόσο καλά οικοδομήθηκε η νέα γνώση. Αρχικά η αξιολόγηση των μαθητών μπορεί να γίνει με τη μέθοδο της παρατήρησης. Στη διάρκεια του μαθήματος ο καθηγητής θα πρέπει να παρακολουθεί τους μαθητές και να καταγράφει (με μορφή βαθμολόγησης) τις παρατηρήσεις του σε κατάλληλο φύλλο. Μπορεί επίσης να ετοιμάσει ένα σύντομο τέστ, που μπορεί να είναι αποθηκευμένο στη σελίδα του καθηγητή στο ίντερνετ ή στο e-class του σχολικού δικτύου. Οι μαθητές μπορούν να απαντούν γραπτά το τέστ και έτσι ο καθηγητής θα είναι σε θέση να κάνει τη βαθμολόγηση στο σπίτι και να τα επιστρέψει διορθωμένα στο επόμενο μάθημα.
Έτσι μπορεί να ελέγξει αν αποκτήθηκαν οι γνώσεις, αν μορφώθηκαν στάσεις και συμπεριφορές, αν γενικά πέτυχε τους στόχους που είχε αρχικά θέσει και σε ποιο ποσοστό. Αν δεν τους πέτυχε, να ελέγξει τι έφταιξε.
Ενδεχόμενα προβλήματα και πιθανές λύσεις
Επειδή το παρόν σχέδιο μαθήματος στηρίζεται και στην περιήγηση σε συγκεκριμένους ιστοχώρους , ενδέχεται να εμφανιστούν προβλήματα που οφείλονται στη μη λειτουργία κάποιου ιστοχώρου ή και γενικότερα του Διαδικτύου τη δεδομένη χρονική στιγμή, ο καθηγητής θα πρέπει να έχει ¨κατεβάσει¨ τις ιστοσελίδες με το webstripper, λογισμικό που κάνει αυτή τη δουλειά και διατίθεται ελεύθερα , να τις αποθηκεύσει στον κεντρικό υπολογιστή του εργαστηρίου και έτσι να γίνεται η περιήγηση χωρίς σύνδεση.
[1] ΖΟΥΜΑΔΑΚΗΣ Π., IN VITRO ΚΑΙ IN VIVO ΜΕΛΕΤΕΣ ΤΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΤΩΝ "ΣΦΥΡΟΚΕΦΑΛΩΝ" ΡΙΒΟΕΝΖΥΜΩΝ, ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΚΡΗΤΗΣ,ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΗΡΑΚΛΕΙΟ 1998, σελ.17-33.
[2] http://www.csu.edu.au/faculty/health/biomed/subjects/molbol/DNAstruc.htm
[3] ΔΗΜΟΣΘΕΝΗΣ ΑΔΑΜΙΔΗΣ, επιμελητής Α' ΕΣΥ 21-01-2006, http://www.γιατρός.gr/mel2.php
[4] http://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/ressources/ecologie_evolution_mol/thermus_aquaticus/taquaticus
[5] Kevin Liaw, Bsci 275A Virus Seminar,Dr. Fanning,12.9.03. http://www.cas.vanderbilt.edu/fanninglab/virology/hdv-hbv.htm
[6] http://www.nature.com/embor/journal/v2/n12/fig_tab/embor274_f1.html
[7] www.rsc.org/ej/MB/2005/b503235k/b503235k-f1.gif
[8] Κατσώρης Π., Μοριακή βιολογία Εναλλακτικό διδακτικό υλικό για τη θεματική ενότητα: Οργάνωση της ύλης σε έμβια όντα ,Ε.Α.Π 2005, σελ 66-69
[9] José-Antonio Daròs, Santiago F Elena & Ricardo Flores, Viroids: an Ariadne's thread into the RNA labyrinth, EMBO reports 7, 6, 593–598 (2006) doi:10.1038/sj.embor.7400706
[10] Alberts, Bray, Johnson, Lewis, Raff, Roberts, Walter, Βασικές Αρχές Κυτταρικής Βιολογίας, Εισαγωγή στην Μοριακή Βιολογία του Κυττάρου, Ιατρικές Εκδόσεις Π.Χ. Πασχαλίδης, σελ.278-279
[11] Chistian de Duve, Μυνήματα της ζωής, Νόηση, Νόημα και Ύστατη πραγματικότητα, Εκδόσεις Πανεπιστημίου Μακεδονίας, σελ.127-128
[12] PΟ∆ΑΚΗΣ Γ., Eξέλιξη Θεµατική Ενότητα ΓENETIKH, Τόμος Γ, Ε.Α.Π. Πάτρα 2001,σελ.86-91.
[13] William R. Taylor, Transcription and translation in an RNA world, Division of Mathematical Biology, National Institute for Medical Research, The Ridgeway, Mill Hill, London NW7 1AA, UK.
[14] ΖΟΥΜΑΔΑΚΗΣ Π., IN VITRO ΚΑΙ IN VIVO ΜΕΛΕΤΕΣ ΤΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΤΩΝ "ΣΦΥΡΟΚΕΦΑΛΩΝ" ΡΙΒΟΕΝΖΥΜΩΝ, ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΚΡΗΤΗΣ,ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΗΡΑΚΛΕΙΟ 1998, σελ.136.
[15] ΖΟΥΜΑΔΑΚΗΣ Π., IN VITRO ΚΑΙ IN VIVO ΜΕΛΕΤΕΣ ΤΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΤΩΝ "ΣΦΥΡΟΚΕΦΑΛΩΝ" ΡΙΒΟΕΝΖΥΜΩΝ, ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΚΡΗΤΗΣ, ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΗΡΑΚΛΕΙΟ 1998, σελ.158
[16] Καψάλης Α., κ.α., Βιολογία γενικής παιδείας Β’ τάξης ενιαίου λυκείου, Βιβλίο καθηγητή ΟΕΔΒ , σελ 14-15.
[17] Αργύρης Ι., Ειδική Διδακτική της Βιολογίας, 2η έκδοση, Θεσσαλονίκη 2002,
[18] Βαλάκας Γ., κ.α., ΕΚΕΠΙΣ 2006, Εκπαιδευτικό υλικό για τους εκπαιδευτές θεωρητικής κατάρτισης τόμος Ι , σελ. 201.
σελ83.
[19] http://kirki.cti.gr/2ndProductGroup/Modellus.htm
[20] The mona Group LLC, LIFE: The science of biology, 5th ed., 14. The Eukaryotic Genome and its Expression, 1998, http://www.monagroup.com
[21] Cambell, Reece, Mitchell, Interactive Study Partner to accompany Biology, Fifth Edition, Chapter 17 ,From the Gene to protein, Activity 17.3 RNA Processing.
19. Si και mi RNA: Ανακάλυψη, ρόλος και μελλοντικές προοπτικές
Μικρά RNA (micro RNA, miRNA)
Εν αντιθέσει προς τη φυσική ή τα μαθηματικά, η βιολογία είναι ίσως η μόνη θετική επιστήμη η οποία δεν «αγαπά» τα δόγματα και τις οικουμενικές αλήθειες. Φυσικά αυτό δεν είναι τυχαίο: η ρευστότητα της ζωής είναι τέτοια που έχει υπαγορεύσει στους βιολόγους τη στάση τους απέναντι σε αυτή. Παρ' όλα αυτά, για δεκαετίες οι φοιτητές βιολογίας διδάσκονταν το κεντρικό, δόγμα της επιστήμης τους. Σύμφωνα με αυτό, η ροή της πληροφορίας μέσα στο κύτταρο έχει την εξής κατεύθυνση: από το DNA, περνά στο RNA και από εκεί στις πρωτεΐνες. Με άλλα λόγια, τα γονίδια τα οποία είναι κομμάτια DNA, περιέχουν την πληροφορία για τη δημιουργία των πρωτεϊνών την οποία μεταβιβάζουν μέσω του RNA (και ειδικότερα στο mRNA). Η αρχική διατύπωση του δόγματος, το οποίο περιγραφικά συνοψίζεται DNAàRNAàπρωτεΐνη, υπέστη μια αρχική τροποποίηση όταν ανακαλύφθηκαν οι RNA-ιοί. Το γενετικό υλικό των ιών αυτών δεν είναι το DNA, όπως συμβαίνει με την πλειονότητα των οργανισμών, αλλά το RNA. Τώρα το δόγμα θα πρέπει να υποστεί και δεύτερη τροποποίηση: μεταξύ των κομματιών που DNA τα οποία μελέτησαν οι ερευνητές κατά την τελευταία δεκαετία διαπιστώθηκε ότι πολλά δεν κωδικοποιούν για πρωτεΐνες, αλλά για RNA. Η πληροφορία δηλαδή η οποία εμπεριέχεται σε αυτά τα κομμάτια DNA δεν χρησιμοποιείται για τη δημιουργία πρωτεϊνών αλλά για τη δημιουργία μορίων RNA τα οποία ονομάστηκαν microRNAs ή miRNAs.[1]
Τα MicroRNAs (miRNAs) ανήκουν σε µια καινούργια τάξη µικρών, µονόκλωνων µορίων RNA, µε µόλις 22 νουκλεοτίδια µήκος, κατά µέσο όρο, τα οποία δεν κωδικοποιούν πεπτίδια. Λειτουργικός τους ρόλος είναι ο υβριδισµός µε αγγελιοφόρα RNA (mRNA), σε ένα µοτίβο µερικής ή πλήρους συµπληρωµατικότητας που οδηγεί σε παρεµπόδιση της µετάφρασης ή ενδονουκλεοτιδική διάσπαση. Η παρουσία τους σε όλους τους πολυκύτταρους οργανισµούς και η ρύθµιση που επιτελούν στη γονιδιακή έκφραση κατά το µετα-µεταγραφικό επίπεδο, τα καθιστούν ως ένα πολύ δηµοφιλές αντικείµενο µελέτης στη Βιολογία.[2]
Το 1993 ο Ambros και οι συνεργάτες του ανακάλυψαν ότι το lin-4, ένα γονίδιο γνωστό για το ρόλο του στην ανάπτυξη του καινοραβδίτη, δεν κωδικοποιεί για κάποια πρωτεΐνη αλλά παράγει δύο µικρού µεγέθους µόρια RNA Το ένα από τα δύο RNA που µεταγράφονται από το lin-4 έχει µέγεθος 22 και το άλλο ~60 νουκλεοτίδια. Το µεγαλύτερο RNA είχε προταθεί ότι έχει δευτεροταγή δοµή που µοιάζει µε φουρκέτα και ότι είναι το πρόδροµο µόριο του µικρότερου. Αργότερα, βρέθηκε ότι στην
Αυτά τα µικρού µεγέθους µόρια RNA επειδή ορίζανε τα χρονικά όρια των αναπτυξιακών σταδίων την προνύµφης του καινοραβδίτη ονοµάστηκαν «µικρά χρονικά RNA» (small temporal RNA, stRNA). Τα stRNA επειδή είχαν αυστηρά καθορισµένη λειτουργία θεωρήθηκε ότι ήταν µία κατηγορία γονιδίων χαρακτηριστική για τον καινοραβδίτη Την εποχή που διαφάνηκε η άµεση σχέση των siRNA µε τη PTGS/RNAi και ο σηµαντικός τους ρόλος στην ρύθµιση των γονιδίων σε µεταγραφικό και µετα-µεταγραφικό επίπεδο, τρεις διαφορετικές ερευνητικές οµάδες ανέπτυξαν τεχνικές χαρακτηρισµού και αλληλούχισης µικροµοριακών RNA, µε σκοπό να ανακαλύψουν ενδογενή siRNA. Η ανάλυση αυτή αποκάλυψε διάφορα µικρού µεγέθους µονόκλωνα µόρια RNA µε δοµική οµοιότητα µε τα lin-4 και let-7. Τα µόρια αυτά ανακαλύφθηκαν αρχικά στην ∆ροσόφιλα (Εικόνα 1)και στο καινοραβδίτη σήµερα οµόλογα γονίδια έχουν βρεθεί επιπλέον στα θηλαστικά και στα φυτά και είναι γνωστά σαν «µικρά RNA» (micro RNA,miRNA). [3]
Εικόνα 1. microRNA διαδικασία ανίχνευσης στόχων για το D. Melanogaster[4]
Τα miRNA συνδέονται με τα mRNA Η σύνδεση δεν είναι τυχαία: απαιτείται συμπληρωματικότητα των βάσεων για να επιτευχθεί. Καθώς όμως το mRNA οφείλει να είναι μονόκλωνο προκειμένου να αξιοποιηθεί η πληροφορία που κουβαλά, η σύνδεσή του το συμπληρωματικό miRNA (και η δημιουργία δίκλωνου μορίου) έχει σαν αποτέλεσμα την αναστολή της ροής της πληροφορίας. Με άλλα λόγια, όταν ένα mRNA συνδέεται με το συμπληρωματικό miRNA του, η σύνθεση της αντίστοιχης πρωτεΐνης σταματά. (Εικόνα 3) [1]
Εικόνα 3 Αναστολή της μετάφρασης και αποικοδόμηση στόχων mRNA.[5]
Ο συνδυασµός της γενετικής πληροφορίας που διαθέτουµε από την αλληλούχιση των γονιδιωµάτων και η δυνατότητα χρήσης υπολογιστικών αλγόριθµων, ήταν καθοριστικοί παράγοντες για την ανεύρευση, αρχικά in silico, των γονιδίων miRNA. Ήδη στις βάσεις δεδοµένων υπάρχει σηµαντική πληροφορία για την γενετική θέση και τη αλληλουχία αυτών των γονιδίων miRNA όπου έχουν ανακαλυφθεί. Παραδείγµατα προδρόµων miRNA. Χαρακτηριστική δευτεροταγής δοµή της φουρκέτας των pre-miRNA ορισµένων miRNA. Με κόκκινους χαρακτήρες σηµειώνεται το ώριµο miRNA όπως θα προκύψει µετά το τελευταίο στάδιο ωρίµανσης. Τα γονίδια των miRNA ανήκουν στην οµάδα των γονιδίων που δεν κωδικοποιούν πρωτεΐνη ενώ το τελικό προϊόν τους είναι ένα µονόκλωνο µόριο RNA µεγέθους περίπου 22 νουκλεοτιδίων. Το ιδιαίτερο χαρακτηριστικό αυτών των γονιδίων είναι ότι τα πρόδροµα µετάγραφα έχουν δευτεροταγή δοµή φουρκέτας (Εικόνα 4) γεγονός που βοήθησε στην ανάπτυξη των υπολογιστικών αλγορίθµων. Οι πρώτοι αλγόριθµοι που σχεδιάστηκαν βασίστηκαν σε αυτή τη παρατήρηση και ερευνούσανε το γένωµα για περιοχές όπου η αλληλουχία τους θα επέτρεπε τη δηµιουργία δοµής φουρκέτας Η ανίχνευση των γενοµάτων µε υπολογιστικές µεθόδους σε συνδυασµό µε µεθόδους της µοριακής βιολογίας έδωσαν πολλές πληροφορίες για την αλληλουχία και τη δοµή αυτών των γονιδίων. ∆εδοµένου του όγκου της πληροφορίας που έχουµε σήµερα για αυτά τα γονίδια δεν φαίνεται να παρουσιάζουν κάποια συγκεκριµένη δοµή στη κατανοµή τους γένωµα. Εµφανίζονται σε όλες τις δυνατές γενετικές θέσεις βρίσκονται κυρίως µεταξύ γονιδίων αλλά έχουν εντοπιστεί και στα εσώνια γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες. Μπορεί κάθε γονίδιο miRNA να υπάρχει µεµονωµένο ή πολλά µαζί να οργανώνονται σε δοµές που θυµίζουν τα οπερόνια των προκαρυωτικών οργανισµών.[3]
Εικόνα 4. Ένα ευδιάκριτο χαρακτηριστικό ενός γονιδίου miRNA είναι ότι το αντίγραφό του είναι σε θέση να διπλώσει σε μια δομή μίσχος-βρόχων όπως εμφανίζεται παραπάνω - το αποκαλούμενο πρόδρομο miRNA. Το πραγματικό miRNA (που τονίζεται στο κόκκινο) αποκόβεται αυτού του πρόδρομου από ένα βασικό ένζυμο αποκαλούμενο DICER.[6]
Τα γονίδια των miRNA κωδικοποιούν ένα πρόδροµο µετάγραφο miRNA το οποίο τροποποιείται για να παραχθεί τελικά το miRNA. Συνεπώς ακολουθούν διάφορα στάδια ωρίµανσης του αρχικού µεταγράφου µέχρι να παραχθεί το ώριµο miRNA. Το αρχικό ή πρώιµο µετάγραφο ονοµάζεται pri-miRNA και µπορεί να είναι µονοκιστρονικό ή πολυκιστρονικό ανάλογα από την οργάνωση των γονιδίων από την οποία θα προκύψει. Το πρώτο από τα στάδια της ωρίµανσης γίνεται στον πυρήνα όπου από το pri-miRNA αποµακρύνονται οι επιπλέον αλληλουχίες που µπορεί να φέρει από τη διαδικασία της µεταγραφής και µετατρέπεται σε πρόδροµο miRNA (pre-miRNA). Στην περίπτωση που το µετάγραφο είναι πολυκιστρονικό διαχωρίζονται ένα-ένα τα pre-miRNA. Ένα pre-miRNA έχει µέγεθος περίπου 60-80 νουκλεοτίδιων και διατηρεί την δοµή της φουρκέτας. Στη συνέχεια το pre-miRNA εξέρχεται από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασµα για το τελευταίο στάδιο της ωρίµανσης του που είναι η αποκοπή του miRNA (Εικόνα 5 ). [3]
Εικόνα 5 miRNA Βιογένεση.[7]
Από την εποχή που ξεκίνησε ο χαρακτηρισµός της λειτουργίας των miRNA φάνηκε ότι συµµετέχουν στα περισσότερα βιοχηµικά και αναπτυξιακά µονοπάτια. Γενετικές µεταλλαγές που δεν µπορούσαν συσχετισθούν µε την λειτουργία κάποιας πρωτεΐνης συχνά αποδεικνύονταν ότι οφείλονταν σε ένα γονίδιο miRNA Πως όµως λειτουργούν τα miRNA; Τα stRNA όπως έχει ήδη αναφερθεί αποτελούν τα πρότυπα µέλη των miRNΑ, για την δοµή τους αλλά για την λειτουργία τους. Τα lin-4 και let-7 είχε προταθεί ότι ελέγχουν την έκφραση των γονιδίων σε µετα-µεταγραφικό επίπεδο ελέγχοντας την µετάφραση των µεταγράφων συγκεκριµένων γονιδίων στόχων. Είχε προταθεί ότι τα stRNA ελέγχουν τη µετάφραση ορισµένων mRNA µέσω πρόσδεσης τους σε συγκεκριµένες θέσεις στη
Εικόνα 6 Λειτουργίες του miRNA.[8]
Αν και η πρώτη παρατήρηση σχετικά με την ύπαρξη και τον ρόλο των miRNa έγινε πριν από 10 περίπου χρόνια, από επιστήμονες οι οποίοι εργάζονταν με τον γεωσκώληκα Caenorhabditis elegans, χρειάστηκε να περάσει πολύς καιρός για να πειστεί η επιστημονική κοινότητα για την ευρύτερη παρουσία τους σε άλλους οργανισμούς. Σήμερα έχει διαπιστωθεί η παρουσία τους στο φυτό Arabidopsis thaliana, (Εικόνα7) στη μύγα του ξιδιού Drosophila melanogaster, αλλά και στους ανθρώπους. [1]
Εικόνα 7. Τα υγιή φυτά (arabidopsis) στα αριστερά έχουν αναπτυχθεί κανονικά ενώ τα φυτά στα δεξιά έχουν μια μετάλλαξη ώστε να λείπει ένα σημαντικό miRNA. [6]
Όλα δείχνουν πως για το κύτταρο, τα miRNA είναι μόρια κλειδιά στη ρύθμιση της παραγωγής πρωτεϊνών. Για τους επιστήμονες όμως είναι και ένα καλό εργαλείο μελέτης και επέμβασης στα βιολογικά συστήματα με στόχο την κατανόησή τους αλλά και την αντιμετώπιση των ασθενειών. Τον περασμένο μήνα αμερικανοί ερευνητές μπόρεσαν να μελετήσουν τον ρόλο των πρωτεϊνών που κωδικοποιούνται από συγκεκριμένα γονίδια του C. elegans εισάγοντας στο μικρό αυτό πειραματόζωο συνθετικά μικρά δίκλωνα RNA τα οποία, όπως και τα miRNA, διέκοψαν την πρωτεϊνοσύνθεση. Με άλλα λόγια, οι αμερικανοί επιστήμονες μελέτησαν τι συνέβαινε στο πειραματόζωο όταν η σύνθεση κάποιας πρωτεΐνης διακοπτόταν. Με τον τρόπο αυτό οι ερευνητές μπόρεσαν να εντοπίσουν 400 γονίδια τα οποία εμπλέκονται στην παραγωγή και αποθήκευση λίπους. Καθώς 200 από αυτά τα γονίδια έχουν ανάλογό τους στον άνθρωπο, από τα ευρήματά τους ελπίζουν να αναπτύξουν φάρμακα για την παχυσαρκία η οποία εξελίσσεται στη μάστιγα του 21ου αιώνα. Επίσης εφαρμόζοντας την ίδια τεχνική, η οποία ονομάζεται RNA interference (παρέμβαση από το RNA), δύο διαφορετικές ερευνητικές ομάδες πέτυχαν να αναστείλουν τη σύνθεση βασικών πρωτεϊνών του ιού HIV, ο οποίος προκαλεί το σύνδρομο της επίκτητης ανοσολογικής ανεπάρκειας στους ανθρώπους (AIDS). Η αναστολή της σύνθεσης αυτών των πρωτεϊνών του ιού μείωσε κατά 50% τη δυνατότητά του να αναπαράγεται στα κύτταρα που χρησιμοποιήθηκαν για τον πειραματισμό, γεγονός που κάνει τους επιστήμονες αισιόδοξους για τις θεραπευτικές δυνατότητες της τεχνικής. [1]
Μια πρόσφατη μελέτη καταδεικνύει το ρόλο των miRNAs στη ρύθμιση του μυικού παγκρεατικού ενδοκρινούς ιστού Ένα νέο miRNA, το "miR-375",ειδικό για τα παγκρεατικά κύτταρα νησίδες, καταστέλλει την έκφραση της myotrophin (Mtpn), μιας πρωτεϊνης που περιλαμβάνεται στο ακραίο στάδιο της έκκρισης ινσουλίνης στα παγκρεατικά βήτα κύτταρα. Η υπερέκφραση miR375 επηρεάζει την απόκριση των βήτα κυττάρων στη γλυκόζη με την καταστολή της έκκρισης ινσουλίνης και η παρεμπόδισή της ενισχύει την έκκριση ινσουλίνης (Εικόνα 8). Τέτοια πρόϊμη-κατάσταση ελέγχου της έκκρισης ινσουλίνης είναι πιθανό να είναι ένας ασφαλής μηχανισμός για να εξασφαλίσει normoglycemia.[9]
Εικόνα 8. Μεταφραστική καταστολή της myotrophin από miR-375.[9]
Μπορεί το microRNA να βάλει φρένο στον καρκίνο;
Μια μελέτη του 2005 στο περιοδικό Nature διαπίστωσε ότι η μέτρηση των επιπέδων των ακριβώς 217 microRNAs θα μπορούσε να παραγάγει σαφέστερες γενετικές υπογραφές για τους όγκους από 16.000 ελέγχους για το mRNA. Ενθαρρυνμένοι από αυτά τα αποτελέσματα, οι Slack και Weidhaas ελπίζουν μέσα σε δύο έτη να τελειοποιηθεί μια microRΝΑ-βασισμένη συσκευή διαλογής που θα μπορούσε να βοηθήσει να προσαρμόσει τις θεραπείες καρκίνου στους τύπους όγκων των ασθενών, και είναι στα αρχικά στάδια της δοκιμής μιας εισπνευστικής θεραπείας let-7 για να χαλιναγωγήσουν την ανεξέλεγκτη αύξηση κυττάρων του καρκίνου πνευμόνων. [10]
Ένα βρετανικό και ένα ολλανδικό ινστιτούτο αποφάσισαν να επενδύσουν 500.000 στερλίνες σε ένα πρόγραμμα το οποίο στοχεύει στο να απόκαλύψει τον ρόλο 800 γονιδίων που σχετίζονται με τον καρκίνο χρησιμοποιώντας την τεχνική RNA interference (παρέμβαση από το RNA). Εκτιμάται ότι η επαναστατική αυτή τεχνική θα παράσχει στους επιστήμονες τη δυνατότητα να «βγάλουν νόημα» από την πληροφορία που συγκεντρώθηκε από την αποκωδικοποίηση του ανθρωπίνου γονιδιώματος. Οι ερευνητές ελπίζουν να χρησιμοποιήσουν αργότερα την τεχνική σε όλα τα 35.000 ανθρώπινα γονίδια, προσπάθεια που υπολογίζεται ότι θα κοστίσει περί τα 3 εκατ. στερλίνες.[1]
Η µελέτη ρύθµισης της µετάφρασης µετά την ανακάλυψη των miRNA µπαίνει σε µία νέα εποχή. Ο ρόλος της
Στις αρχές της δεκαετίας του ’90 όταν η γενετική τροποποίηση των φυτών ήταν δυνατή µια οµάδα ερευνητών αποφάσισε να κατασκευάσει διαγονιδιακά φυτά που θα υπερεκφράζουν το γονίδιο της χαλκοσυνθάσης Α. Υποθέτανε ότι υπερέκφραση του γονίδιου της χαλκοσυνθάσης στην πετούνια, θα οδηγούσε στην δηµιουργία φυτών που θα φέρανε άνθη µε εντονότερο µοβ χρώµα από αυτό των φυτών αγρίου τύπου. Προς µεγάλη τους έκπληξη τα άνθη των διαγονιδιακών φυτών ήταν λευκά ή εµφάνισαν µωσαϊκό λευκών και ερυθρών χρωµάτων Τα παραπάνω αποτελέσµατα οδήγησαν στη διατύπωση της θεωρίας της «συγκαταστολής» (co-suppression) σύµφωνα µε την οποία όταν στο γένωµα συναντώνται οµόλογα (δια)γονίδια αυτά αλληλοκαταστέλλονται. Φαινότυποι συγκαταστολής του γονιδίου της χαλκοσυνθάσης σε άνθη πετούνιας. Το φαινόµενο της συγκαταστολής έχει µετα-µεταγραφική ρύθµιση Τα φυτά που φέρουν ως διαγονίδια κωδικές περιοχές του γενώµατος ιών παρουσιάζουν ανθεκτικότητα στο συγκεκριµένο ιό Η «ανθεκτικότητα προερχόµενη από το παθογόνο» βασιζόταν στην οµολογία µεταξύ του διαγονιδίου και του ιού Η ανθεκτικότητα του διαγονιδιακού φυτού στο παθογόνο οφείλονταν στην αδυναµία του παθογόνου να πολλαπλασιαστεί µέσα στον ξενιστή. Αρχικά είχε προταθεί ότι η καταστολή του πολλαπλασιασµού του ιού, γίνεται λόγω αλληλεπίδρασης του προϊόντος (πρωτεΐνης) του διαγονιδίου που φέρει ο ξενιστής, το οποίο κατά κάποιο τρόπο παρεµβαίνει στον πολλαπλασιασµό του παθογόνου Πέντε χρόνια αργότερα ο Lindbo παρατήρησε ότι µπορούσε να επάγει PDS σε διαγονιδιακά φυτά που φέρανε διαγονίδια οµόλογα µε την
Αν το dsRNA επάγει την PTGS/RNAi γιατί δεν ανιχνεύουµε την αντικωδική αλυσίδα του RNA (asRNA); Μήπως γιατί έχει πολύ µικρό µέγεθος; Την παραπάνω υπόθεση αποφάσισαν να ερευνήσουν οι Hamilton και Baulcombe, και τα αποτελέσµατα που πήραν αποτέλεσαν τον τρίτο και σηµαντικότερο σταθµό στη ερεύνα της PTGS/RNAi. Αποµόνωσαν εκχυλίσµατα RNA από φυτά στα είχε επαχθεί η PTGS/RNAi µε την παρουσία ενός διαγονιδίου οµόλογου για ένα ενδογενές γονίδιο ή µε VIGS. Από την ανάλυση των δειγµάτων ανακάλυψαν µία οµάδα µικρών µορίων RNA τα οποία σχετίζονταν µε την PTGS. Ειδικότερα σε φυτά όπου είχε επαχθεί η PTGS, άσχετα µε πιο τρόπο έχει γίνει, ανιχνεύανε µία συγκεκριµένη οµάδα µορίων RNA µεγέθους περίπου 21-22 νουκλεοτιδίων. Τα µικρά αυτά RNA ανιχνεύονταν αποκλειστικά στα δείγµατα που προέκυπταν από φυτά που παρουσίαζαν σίγηση. Σε κάθε δείγµα όπου ανιχνεύανε τα µικρά RNA µπορούσαν να ανιχνεύσουν την κωδική και την αντικωδική αλυσίδα ενώ δεν µπορούσαν να ανιχνεύσουν το mRNA του γονιδίου που στοχεύανε. Στα δείγµατα όπου δεν παρουσιάζανε PTGS δεν ανιχνεύανε µικρά RNA ενώ το mRNA του γονιδίου ήταν ακέραιο. Τα µικρά RNA ή µικρά παρεµβαλλόµενα RNA (short interfering RNA, siRNA) όπως ονοµάστηκαν αργότερα, ανιχνεύονται σε όλους τους οργανισµούς όπου επάγεται η PTGS/RNAi και αποτελούν πλέον το µοριακό δείκτη της επαγωγής του φαινοµένου.[12]
Τα siRNA είναι δίκλωνα και το µέγεθος τους κυµαίνεται από 21-25 περίπου νουκλεοτίδια. Η ακριβής δοµή των siRNA διευκρινίστηκε πλήρως όταν ανακαλύφθηκε στη ∆ροσόφιλα η πρωτεΐνη που είναι υπεύθυνη για την παραγωγή τους. Η πρωτεΐνη Dicer, όπως ονοµάστηκε εξαιτίας της ικανότητας της να πέπτει dsRNA σε καθορισµένα κοµµάτια, αποµονώθηκε από κυτταρικά εκχυλίσµατα εµβρύων ∆ροσόφιλας H πρωτεΐνη Dicer φέρει δύο περιοχές οµόλογες µε την RNaseΙΙΙ των βακτηρίων, µία περιοχή ελικάσης, µία πρόσδεσης και αναγνώρισης dsRNA, και συνήθως µία περιοχή πρόσδεσης RNA, την Paz. Η οµολογία των δύο περιοχών της µε τις νουκλεάσες RNaseΙΙΙ των βακτηρίων αποτέλεσε και το κλειδί στο τι δοµή µπορεί να έχουν τα siRNA. Οι ριβονουκλεάσες τύπου ΙΙΙ αναγνωρίζουν και πέπτουν dsRNA σε κοµµάτια µεγέθους 17-25 νουκλεοτιδίων Ένα τυπικό προϊόν πέψης dsRNA από µία RNase τύπου ΙΙΙ χαρακτηρίζεται από τα άκρα του τα οποία έχουν στο
Ενώ τα siRNA θα µπορούσαν να θεωρηθούν ως το τελικό προϊόν της PTGS/RNAi διαφάνηκε πολύ σύντοµα ότι έχουν και σηµαντικό λειτουργικό ρόλο. Τα siRNA φαίνεται να είναι το µόριο κλειδί που καθορίζει την εξειδίκευση του συστήµατος.(Εικόνα 9) [12]
Εικόνα 9. Μηχανισμός δράσης της RNAi[13]
Έχει δειχθεί πολλές φορές ότι µεταφορά siRNA σε ολόκληρο οργανισµό ή κυτταρική σειρά µπορεί να επάγει πολύ αποτελεσµατικά την αποικοδόµηση συγκεκριµένων µορίων στόχων Το µονοπάτι της PTGS/RNAi µπορεί να διαχωριστεί σε τέσσερα χαρακτηριστικά λειτουργικά στάδια Το πρώτο στάδιο απαιτεί την κατανάλωση ATP και είναι ανεξάρτητο από τη αλληλουχία των µορίων RNA που συµµετέχουν. Αυτό είναι το στάδιο πέψης του dsRNA σε siRNA. Στο δεύτερο στάδιο τα siRNA χωρίς την απαίτηση για ATP φορτώνονται σε ένα σύµπλοκο πρωτεϊνών γνωστό ως RISC (RNA-Induced Silencing Complex). Στο επόµενο στάδιο µε την κατανάλωση ενέργειας και µε την βοήθεια µιας ελικάσης διαχωρίζονται οι δύο αλυσίδες των siRNA. Το τέταρτο και τελευταίο στάδιο είναι το στάδιο όπου το σύµπλοκο RISC χρησιµοποιώντας την αλυσίδα των siRNA ως οδηγό αναγνωρίζει και πέπτει τα RNA στόχους. Το σύµπλοκο RISC φαίνεται να παίζει κυρίαρχο ρόλο στην διαδικασία της PTGS/RNAi. Παρόλο που γνωρίζουµε κάποιες από τις ενεργότητες του συµπλόκου, δεν έχουν χαρακτηριστεί πλήρως οι πρωτεΐνες όπου συµµετέχουν Γενικά γνωρίζουµε ότι η RISC ενεργοποιείται µόνο όταν προσδεθούν τα siRNΑ Μια από τις πρωτεΐνες του συµπλέγµατος πρέπει να έχει δράση RNA ελικάσης για να αποδεσµεύεται η µία από τις δύο αλυσίδες των siRNA (Εικόνα 10)Τέλος, έχει αποδειχθεί ότι το σύµπλοκο φέρει και ενεργότητα RNase η οποία είναι απαραίτητη και την πέψη των µορίων RNA που αναγνωρίζονται. [12]
Εικόνα 10 Μηχανισμός siRNA σίγασης.[14]
(TGS) Πριν µελετηθεί διεξοδικά η PTGS, γνωρίζαµε ότι γονιδιακή σίγηση µεταξύ οµόλογων γονιδίων σε µεταγραφικό επίπεδο µπορεί να έχουµε µε την µεθυλίωση των υποκινητών τους. Η«µεταγραφική γονιδιακή σίγηση» (Transcriptional Gene Silencing, TGS) και αργότερα η PTGS/RNAi είναι δύο µηχανισµοί του φαινοµένου της συγκαταστολής ή καλύτερα της «γονιδιακής σίγησης βασιζόµενη στην οµολογία» των γονιδίων Το βασικό κοινό χαρακτηριστικό των δύο µηχανισµών HDGS είναι ότι πρέπει να υπάρχει σηµαντικό ποσοστό οµολογίας µεταξύ των γονιδίων που µπαίνουν σε κατάσταση σίγησης. Επίσης προκειµένου να εδραιωθεί η σίγηση και στις δύο περιπτώσεις ακολουθεί µεθυλίωση των περιοχών των γονιδίων. Στην περίπτωση της TGS η σίγηση γίνεται κυρίως µε µεθυλίωση του υποκινητή. Η PTGS/RNAi όπως γνωρίζουµε εξελίσσεται σε µετα-µεταγραφικό επίπεδο και έχει παροδικό χαρακτήρα δηλαδή σε κάθε νέα κυτταρική γενιά επαναπροσδιορίζεται. Το φαινόµενο της TGS λόγω της µεθυλίωσης είναι σταθερό και είναι ένα χαρακτηριστικό που κληρονοµείται στα νέα κύτταρα. Πρόσφατα παρατηρήθηκαν φαινόµενα µεθυλίωσης της κωδικής περιοχής των γονιδίων που είχαν υποστεί σίγηση σε µετα-µεταγραφικό επίπεδο Ενώ ήταν τεχνικά εύκολο να αποδειχθούν τα φαινόµενα της µεθυλίωσης στο επίπεδο του DNA και για τους δύο µηχανισµούς, αυτό που δεν µπορούσε να κατανοηθεί ήταν το πώς εξασφαλιζόταν ότι µόνο τα οµόλογα (δια)γονίδια θα µεθυλιωθούν. Το ερώτηµα απαντήθηκε µε την ανακάλυψη των siRNA. Τα siRNA φαίνεται ότι είναι ο οδηγός µε τον οποίο καθοδηγούνται οι µηχανισµοί µεθυλίωσης του πυρήνα για το ποιες περιοχές πρέπει να µεθυλιωθούν. Οι συσχέτιση των siRNA µε την µεθυλίωση έχει αποδειχθεί µε την κατασκευή διαγονιδιακών φυτών που φέρουν συστήµατα διαγονιδίων. Το ένα διαγονίδιο µεταγράφεται σε RNA µε δοµή φουρκέτας, το οποίο έχει αλληλουχία οµόλογη µε τον υποκινητή ενός δεύτερου διαγονιδίου που βρίσκεται στο ίδιο φυτό Τα RNA µε τη δίκλωνη δοµή τους επάγουν PTGS/RNAi γεγονός που αποδεικνύεται από την παρουσία των οµολόγων siRNA. Η επαγωγή της PTGS/RNAi σχετίζεται άµεσα µε το φαινόµενο της µεταγραφικής σίγησης που παρατηρείται για το δεύτερο διαγονίδιο. Απάντηση στο ερώτηµα για το πώς στοχεύονται από τα siRNA περιοχές των γονιδίων που δεν µεταγράφονται, όπως οι υποκινητές, δεν µπορεί να δοθεί µε σιγουριά. Το µοντέλο που προτείνεται είναι ότι αρχικά η µεθυλίωση ξεκινά στην κωδική περιοχή του γονιδίου που υπόκεινται σε PTGS. Τελικά από γενιά σε γενιά κυττάρων η µεθυλίωση εξαπλώνεται προς τηνπεριοχή του υποκινητή µετατρέποντας ουσιαστικά τη PTGS σε TGS Τα περισσότερα ερωτήµατα και σε αυτή τη περίπτωση παραµένουν ανοιχτά. Όπως ανοιχτό είναι και το ερώτηµα του τι επάγει τελικά την PTGS/RNAi. Το γεγονός ότι το dsRNA και τα siRNA µπορούν να επάγουν τη PTGS/RNAi, µπορούν να µας οδηγήσουν στο σχεδιασµό ορισµένων µοντέλων που περιγράφουν το µονοπάτι. Επειδή όµως το dsRNA και τα siRNA φαίνεται να παίζουν ρόλο στα ενδιάµεσα στάδια το ερώτηµα παραµένει, πιο είναι το εναρκτήριο σήµα; Όσοι υποστηρίζουν το µοντέλο του έκτροπου RNA (abRNA) θεωρούν ότι η µεθυλίωση στην κωδική περιοχή ενός γονιδίου οδηγεί στην µεταγραφή abRNA τα οποία επάγουν την PTGS. Μετά την επαγωγή το φαινόµενο ενισχύεται µε επιπλέον µεθυλίωση όσο αφορά το πυρηνικό κοµµάτι. Το µοντέλο αυτό όµως δεν απαντά το ερώτηµα για το τι γίνεται σε οργανισµούς όπως τη ∆ροσόφιλα ή τον καινοραβδίτη οπού δεν διαθέτουν µηχανισµούς µεθυλίωσης του DNA τους αλλά επάγουν κατά πολύ οµόλογο τρόπο µε τα φυτά PTGS/RNAi. [12]
Σηµαντικός ρόλος, αν και πάλι όχι πλήρως ξεκάθαρος, προσδίδεται στα siRNA όσον αφορά τη διασυστηµατική µεταφορά της PTGS/RNAi. Τα siRNA εµπλέκονται µε τη διασυστηµατική µεταφορά της PTGS/RNAi µε δύο τρόπους είτε να µεταφέρονται τα ίδια, είτε να συµµετέχουν στην ενίσχυση του διασυστηµατικού σήµατος. Όπως σε όλες τις περιπτώσεις που αφορούν αυτό το µονοπάτι έτσι και σε αυτή υπάρχουν ενδείξεις που υποστηρίζουν και τις δύο πιθανότητες. Η διασυστηµατική µεταφορά της PTGS/RNAi έχει αποδειχθεί για τον καινοραβδίτη και τα φυτά, αλλά έχει µελετηθεί εκτενώς στα φυτά Σύµφωνα µε το µοντέλο µία οµάδα κυττάρων στα οποία έχει επαχθεί η PTGS/RNAi παράγουν ένα σήµα το οποίο µε κάποιο τρόπο µεταφέρεται µέσα στον οργανισµό και επάγει σίγηση στα νέα κύτταρα. Το σύστηµα της διασυστηµατικής µεταφοράς έχει απόλυτη εξειδίκευση για το RNA που στοχεύεται και µόνο αυτό τελικά αποικοδοµείται. Εξαιτίας της εξειδίκευσης του συστήµατος υποθέτουµε ότι το διασυστηµατικό σήµα είναι νουκλεϊκό οξύ και κατά πάσα πιθανότητα είναι RNA. Είναι όµως τα siRNA; Μέχρι τώρα έχουµε δει τα siRNA να καθοδηγούν την RISC για την αναγνώριση των RNA που πρέπει να αποικοδοµηθούν, ενώ παράλληλα καθορίζουν και στο επίπεδο του DNA ποιες περιοχές θα µεθυλιωθούν. Πειράµατα εµβολιάσµατος φυτών που εκφράζουν ιικές πρωτεΐνες που δεσµεύουν τα siRNA, δείχνουν ότι όταν στο υποκείµενο δεσµευτούν τα siRNA στις ιικές πρωτεΐνες το σήµα που επάγει τη PTGS στο εµβόλιο εξακολουθεί να λειτουργεί Οι παραπάνω παρατηρήσεις δείχνουν ότι κατά πάσα πιθανότητα τα siRNA δεν αποτελούν το διασυστηµατικό σήµα. Τα siRNA στα φυτά εµφανίζονται σε δύο οµάδες, η πρώτη περιλαµβάνει τα «κοντά» siRNA που έχουν µέγεθος 21-22 νουκλεοτίδια και η δεύτερη τα «µακριά» siRNA µε µέγεθος 24-26 νουκλεοτίδια. Οι δύο οµάδες siRNA φαίνεται ότι έχουν σαφή λειτουργικό διαχωρισµό Η οµάδα των «κοντών» siRNA σχετίζεται µε την αναγνώριση και την αποικοδόµηση των µορίων στόχων, ενώ τα «µακριά» siRNA σχετίζονται µε τη διασυστηµατική µεταφορά. Αφού είναι γνωστό ότι τα «κοντά» siRNA δεν είναι το διασυστηµατικό σήµα θα µπορούσε να είναι τα «µακριά» siRNA; Η οµάδα του Zamore που σχετίζει τα «µακριά» siRNA µε την ενεργοποίηση του ενζύµου RdRp (RNA dependent RNA polymerase) περιπλέκει τα πράγµατα Η RNA-εξαρτώµενη RNA πολυµεράση (RNA-dependent(directed)-RNA-polymerase, RdRp) είναι µία κυτταροπλασµατική πολυµεράση η οποία σχετίζεται µε τον πολλαπλασιασµό των φυτικών RNA ιών. Ενδογενείς οµόλογες πρωτεΐνες έχουν χαρακτηριστεί για την τοµάτα και το καινοραβδίτη Από ανάλυση σε µεταλλαγές της πρωτεΐνης δείχνουν ότι παίζει ρόλο στην επαγωγή της PTGS/RNAi και για τους δύο οργανισµούς στους οποίους έχει χαρακτηριστεί. Ο ρόλος της RdRp δεν είναι απολύτως ξεκάθαρος, πιθανότατα σχετίζεται µε την παραγωγή του dsRNA. Ο Tang έδειξε ότι σε φυτικά εκχυλίσµατα, τα οποία µπορούν να επάγουν PTGS/RNAi και έχουν ενεργότητα RdRp, όταν εισαγάγανε µονόκλωνο RNA µπορούσαν να εντοπίσουν την de novo συντεθειµένη συµπληρωµατική αλυσίδα. Στις περιπτώσεις όπου η επαγωγή της PTGS στα φυτικά εκχυλίσµατα γινόταν µε την µεσολάβηση της RdRp, τότε τα siRNA που προέκυπταν άνηκαν στην οµάδα των «µακριών» siRNA Συνεπώς η παρατήρηση ότι τα «µακριά» siRNA σχετίζονται µε τη διασυστηµατική µεταφορά θα µπορούσε να σηµαίνει ότι: Όταν το σήµα εισέρχεται στα νέα κύτταρα, επάγεται η RdRp το πολλαπλασιάζει προκειµένου να ενισχυθεί. Μέρος του dsRNA που θα προκύψει δίνει κυρίως τα «µακριά» siRNA και κάποια «κοντά» siRNA. Τα «κοντά» siRNA µε την σειρά τους ενεργοποιούν την RISC. Πως θα µπορούσε εξάλλου να είναι το διασυστηµατικό σήµα αν δεν σχετίζονται µε την αποικοδόµηση των RNA και τη ενεργοποίηση του συµπλόκου της RISC; Τα siRNA έχει προταθεί ότι µπορεί να λειτουργούν ως εκκινητές για να καθοδηγούν την RdRp για το πιο RNA πρέπει να «µεταγράψει». Έχει παρατηρηθεί ότι είναι δυνατό να ανιχνευθούν siRNA που στοχεύουν περιοχές έξω από την περιοχή οµολογίας δύο (δια)γονιδίων. Το µοντέλο που έχει προταθεί είναι ότι η RdRp µεταγράφει το mRNA στόχο για την παραγωγή της αντικωδικής αλυσίδας και κατά συνέπεια του dsRNA. Για να εξασφαλιστεί ότι θα µεταγραφεί το σωστό RNA πιθανολογείται ότι τα siRNA λειτουργούν ως εκκινητές. Έχει δειχθεί στη ∆ροσόφιλα στον καινοραβδίτη και στα φυτά ότι τα siRNA πιθανώς να µπορούν να παίξουν αυτό το ρόλο. [12]
Τα RNA interference (Εικόνα 11) σχετίζονται με φυσικές λειτουργίες καταστολής της γονιδιακής έκφρασης. Φυτά και μύκητες παρουσιάζουν τέτοιου τύπου RNA καταστολή (post transcriptional gene silencing), στην οποία δίκλωνο dsRNA παρεμποδίζει την έκφραση ενός γονιδίου. Μία “πρόχειρη” πηγή τέτοιου RNA στόχου μπορεί να είναι ένας πολλαπλασιαζόμενος ιός, και ο φυσικός μηχανισμός μπορεί να έχει εξελιχθεί σαν άμυνα εναντίον ιικών μολύνσεων. Όταν ένας ιός μολύνει φυτικό κύτταρο, ο σχηματισμός του dsRNA προκαλεί την καταστολή της έκφρασής του από το φυτικό γονιδίωμα. Το siRNA μπορεί να εξαπλωθεί σ’ όλο το φυτό συστηματικά, πιθανόν και μέσω της κίνησης του ίδιου του ιού. Έτσι μία RNA εξαρτώμενη RNAπολυμεράση μπορεί να χρησιμοποιεί το siRNA σαν εκμαγείο και να παράγει πολλαπλά αντίγραφά του που καταστέλλουν το RNA-στόχο.(Εικόνα 12)[15]
Εικόνα 11. Επεμβατικό (interference) siRNA[16]
Εικόνα 12. Στους ανθρώπους, ένα διαφορετικό μοντέλο έχει προταθεί με το οποίο μια Rna-εξαρτώμενη RNA πολυμεράση (RDRP) και μία ελικάση συνδυάζονται με το siRNA προκειμένου να καθοδηγήσει το συγκρότημα στο mRNA. Τα ξετυλιγμένα σκέλη του siRNA ενεργούν ως εκινητήρες για τη δημιουργία των συμπληρωματικών κλώνων μέσω της δραστηριότητας της RDRP. Νέο dsRNA δημιουργείται στη συνέχεια και δέχεται την επίθεση από το Dicer. Κατ' αυτό τον τρόπο περισσότερο siRNA παράγεται και η γονιδιακή σίγαση ενισχύεται.[17]
Εικόνα 13.[18]
Μοντέλο για τα μοναπάτια της παρέμβασης RNA για την παρεμπόδιση παραγωγικής HIV-1 μόλυνσης. si RΝΑ-που κατευθύνεται στον προερχόμενο από ιό δέκτη mRNA εμποδίζει την είσοδο ιών μέσα στα κύτταρα στόχους (Βήμα 1) Η σίγαση του προ-ενσωματωμένου HIV-1 μπορεί να εμφανιστεί από p24 siRNA απευθύνοντας το RISC σύμπλεγμα άμεσα στο HIV-1 γονιδίωμα για να αποτρέψει την ενσωμάτωση (βήμα 2). Επιπλέον, η HIV-1 παραγωγή ιών απογόνων μπορεί να εμποδιστεί με το να κατασιγάσει ολόκληρη HIV-1 έκφραση γονιδίων (mRNA ή genomic RNA) που εκφράζεται από ενσωματωμένο provirus (βήμα 3).(Εικόνα 13)[18]
Πρόσφατα πειραµατικά δεδοµένα µαρτυρούν εποχική διαφοροποίηση στα επίπεδα των µικρών RNAs (ποιοτική και ποσοτική διαφοροποιήση όσον αφορά τις τάξεις µεγέθους 20 nt και 25 nt siRNAs) στο χυµό του φλοιώµατος σε διάφορα φυτά, τα οποία αποδίδονται πιθανότατα σε ανάλογες εποχικές διαφοροποιήσεις ως προς την ανάπτυξη και αντιική άµυνα των φυτών Έτσι µία άµεση µελλοντική προοπτική θα ήταν η αντίστοιχη σύγκριση των επιπέδων των µικρών RNAs (ποιοτικά και ποσοτικά πρότυπα-µοτίβα) κάτω από διαφορετικές συνθήκες φωτισµού (ένταση ή/και ποιότητα φωτός), αποµονώνοντας όµως την επίδραση της θερµοκρασίας σε αντίθεση µε την παραπάνω έρευνα. Eπίσης, ο σχηµατισµός διαφορετικών τύπων µικρών RNAs από διαφορετικές οµόλογες Dicers στα φυτά (οι Dicer 1 και Dicer 3 είναι υπεύθυνες για την παραγωγή τάξης µεγέθους 21 nt και 24 nt siRNAs καθώς επίσης και οι διαφορετικές κινητικές ενεργότητας των αντίστοιχων ενζύµων παρουσία/απουσία ΑΤP (ΑΤP εξαρτώµενη Dicer1 και ΑΤP-ανεξάρτητη Dicer 3 µας υποχρεώνει να ελέγξουµε τα µετάγραφα και τις ενεργότητες αυτών των βασικών ενζύµων-κλειδιών του µηχανισµού στην πειραµατική µας δοµή. Επιπλέον, η εξάρτηση ενός µέλους της οικογένειας των Αργοναυτών από το φώς (ΑGO1), µας υποδεικνύει να σχεδιάσουµε ανάλογα πειράµατα για την Αgo1 καθώς θα ήταν ενδιαφέρον και η περίπτωση της RNA-εξαρτώµενης πολυµεράσης στην οποία αποδίδεται ο ρόλος του πολλαπλασιασµού και ενίσχυσης του σήµατος σίγησης.[19]
Τα τελευταία χρόνια και ενώ ένας µεγάλος αριθµός γονιδίων από πολλά είδη οργανισµών έχει αλληλουχηθεί, η περαιτέρω πρόκληση είναι η κατανόηση της λειτουργίας και τις αλληλεπίδρασης αυτών των γονιδίων. Η χρησιµοποίηση µεταλλαγών, µεταθετών στοιχείων και της τεχνολογίας του T-DNA αποτελούν σηµαντικά εργαλεία µελέτης γονιδίων. Ωστόσο, η εφαρµογή των παραπάνω µεθόδων είναι αρκετά αργή και επίπονη για την αποσαφήνιση της λειτουργίας κάθε γονιδίου. Έχει υπολογιστεί ότι, µέσω της τεχνολογίας του T-DNA, χρειάζονται 350.000 γεγονότα µετασχηµατισµών προκειµένου να βρεθεί η λειτουργία ενός µοναδικού γονιδίου στην Arabidopsis µε πιθανότητα επιτυχίας 90% Οι νέες τεχνολογίες που φαίνεται να αναπτύσσονται στις µέρες µας, όπως είναι η RNAi στα θηλαστικά και η PTGS στα φυτά, υπόσχονται γρήγορη και ακριβή αντίληψη της λειτουργίας των γονιδίων Η εισαγωγή και η έκφραση στους φυτικούς οργανισµούς κατασκευών (hpRNA) που σχηµατίζουν δίκλωνες µορφές RNA (dsRNA), οδηγούν σε σίγηση γονιδίων, ανεξάρτητα αν η κατασκευή έχει στόχο ιϊκό γένωµα, διαγονίδιο ή ακόµη και ενδογονίδιο. Η σίγηση είναι αποτελεσµατική σε καθένα κύτταρο, όπου εκφράζεται η κατασκευή. Οι hpRNA κατασκευές, που φέρουν µία οποιαδήποτε αλληλουχία (αλληλουχία µεσολάβησης) µεταξύ των τµηµάτων που έχουν τοποθετηθεί σε αντίθετη κατεύθυνση (sense και antisense), έχουν αποδειχθεί αποδοτικές αλλά περισσότερο σηµαντικές φαίνεται να είναι εκείνες που φέρουν ως αλληλουχία µεσολάβησης ιντρόνιο. Το µέγεθος των τµηµάτων, που σχηµατίζουν τη δίκλωνη µορφή RNA, µπορεί να κυµαίνεται από 400-880nt και στην περίπτωση που περιλαµβάνει
[1] Το ΒΗΜΑ, 09/02/2003 ,κωδικός άρθρου: B13785H021,ID: 252902, σελ.: H02.
[2] ΒΡΕΤΤΟΣ Ν., ΤΕΚΜΗΡΙΩΣΗ ΚΑΙ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΟΥ ΡΟΛΟΥ ΤΟΥ miR-13, ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ∆ΙΑΤΡΙΒΗ ΤΙΤΛΟΥ ΕΙ∆ΙΚΕΥΣΗΣ, ΗΡΑΚΛΕΙΟ 2004,σελ.10.
[3] Μπούτα Α., Ανάλυση μικρών μορίων RNA που ελέγχουν μετα-μεταγραφικά φαινόμενα ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης, Διδακτορική Διατριβή, Ηράκλειο 2004,σελ.33-36.
[4] www.sanger.ac.uk/Teams/Team101/
[5] www.ebiotrade.com/images/mirna-1.gif
[6] http://images.google.com/imgres?imgurl=http://www-ab.informatik.uni-tuebingen.de/research/mirna/hairpin.jpg&imgrefurl=http://www-ab.informatik.uni-tuebingen.de/research/mirna/welcome.html&h=325&w=502&sz=27&hl=el&start=8&tbnid=cAFsj1-9BadFlM:&tbnh=84&tbnw=130&prev=/images%3Fq%3DMIrna%26svnum%3D10%26hl%3Del%26lr%3D
http://tovima.dolnet.gr/print_article.php?e=B&f=13785&m=H02&aa=1
[7] www.mgm.ufl.edu/.../renne/miRNA-Biogenesis2.jpg
[8] http://bi.snu.ac.kr/ProMiR/microRNA.htm
[10] http://images.google.gr/imgres?imgurl=http://www.medicineatyale.org/v2i2_march_april2006/graphics/miRNA.jpg&imgrefurl=http://www.medicineatyale.org/v2i2_march_april2006/microRNAs.html&h=447&w=312&sz=44&hl=el&start=23&tbnid=dCPhkR7fFoSe6M:&tbnh=127&tbnw=89&prev=/images%3Fq%3DmicroRNAs%26start%3D18%26ndsp%3D18%26svnum%3D10%26hl%3Del%26lr%3D%26sa%3DN
[11] Μπούτα Α., Ανάλυση μικρών μορίων RNA που ελέγχουν μετα-μεταγραφικά φαινόμενα ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης, Διδακτορική Διατριβή, Ηράκλειο 2004,σελ.124.
[12] Μπούτα Α., Ανάλυση μικρών μορίων RNA που ελέγχουν μετα-μεταγραφικά φαινόμενα ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης, Διδακτορική Διατριβή, Ηράκλειο 2004,σελ.14-29.
[13] www.ncbi.nlm.nih.gov/.../images/fig_sirna.gif
[14] www.uni-konstanz.de/.../siRNA%20mechanism.png
[15] Νature 431, 364-370 (16 September 2004) | doi: 10.1038/nature02875 Zachary Lippman & Rob Martienssen THE ROLE OF RNA INTRFERENCE IN HETEROCHROMATIC SILENCING
[16] www.intrexon.com/v10_images/siRNA.gif
[17] www.uq.edu.au/vdu/DNARNAint3.gif
[18] Nature Medicine 8, 681 - 686 (2002) Published online: 3 June 2002; | doi:10.1038/nm725 siRNA-directed inhibition of HIV-1 infection, Carl D. Novina, Michael F. Murray, Derek M. Dykxhoorn, Paul J. Beresford, Jonathan Riess, Sang-Kyung Lee, Ronald G. Collman, Judy Lieberman, Premlata Shankar & Phillip A. Sharp
[19] Κωτάκης Χ., O ρόλος του φωτοσυνθετικού µηχανισµού στη βιοχηµεία του µηχανισµού µετα-µεταγραφικής σίγησης γονιδίων στα ανώτερα φυτά., Ερευνητική διατριβή προς απόκτηση Μεταπτυχιακού Tίτλου Ειδίκευσης στο πρόγραµµα Μοριακής Βιολογίας και Βιοτεχνολογίας Φυτών, Ηράκλειο 2006,σελ.36-37.
[20] ΜΙΣΣΙΟΥ Α., Η δηµιουργία γενετικά τροποποιηµένων φυτών πατάτας που φέρουν ανθεκτικότητα στον ιό της πατάτας Υ (Potato virus Y, PVY), ∆ΙΑΤΡΙΒΗ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟΥ ΤΙΤΛΟΥ ΕΙ∆ΙΚΕΥΣΗΣ, Ηράκλειο 2002,σελ.64-67.
.JPEG&imgrefurl=http://timm.main.teikyo-u.ac.jp/web/pcr.e.html&h=523&w=544&sz=60&hl=el&start=5&tbnid=zICxM2n29cTigM:&tbnh=128&tbnw=133&prev=/images%3Fq%3Drrna%26svnum%3D10%26hl%3Del%26lr%3D){kind=link}
Δεν υπάρχουν σχόλια:
Δημοσίευση σχολίου